Nap1l5基因敲除心肌肥厚小鼠模型

Nap1l5敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。

CRISPR/Cas9技術的優點在于其對基因進行定位的精準編輯，在向導RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。

NAP1L5(Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一種蛋白質編碼基因。與NAP1L5相關的疾病包括Beckwith-Wiedemann綜合征。其主要在兒童發育時期發揮功能，引起一些疾病，而對于該基因在人類衰老階段是否會在心腦血管疾病中發揮功能卻鮮有研究，該研究為Nap1l5的研究提供了新的方向與思路。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

因現階段小鼠模型仍處于繁育階段，所以相關實驗主要集中在細胞上。

為了探究Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我們首先檢測了PE誘導的肥厚的心肌細胞中的Nap1l5中的mRNA的表達水平，發現Nap1l5在PE誘導的肥厚的心肌細胞中的表達顯著上調（圖1A），同時發現在TAC術后的心肌肥厚模型中Napll5的表達同樣顯著上調（圖1B），說明Nap1l5在心肌肥厚的發生中可能發揮重要功能。

為了進一步驗證Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我們通過siRNA對心肌細胞中的Nap1l5進行了敲低，圖1C為敲低水平的檢測，證明siNap1l5能夠顯著敲低Nap1l5的表達；敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標志物Anp、Bnp在心肌細胞中的mRNA的相對表達水平明顯受到了抑制，而Myh6卻明顯上調（圖1D）；而Nap1l5的過表達正好有相反的結果（圖1F），說明Nap1l5在體外確實可以促進心肌細胞的肥厚。

總之，研究結果表明，敲低Nap1l5可以緩解心肌肥厚的發生，而過表達Nap1l5可以促進心肌肥厚的發生。

圖1. Nap1l5 可以促進心肌肥厚。（A、B）Nap1l5及心臟組織心肌肥厚標志物Anp、Bnp、Myh7和Myh6在PE處理的心肌細胞及心臟TAC模型中的mRNA的相對表達水平；（C）Nap1l5敲低水平檢測；（D）敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標志物Anp、Bnp、Myh6在心肌細胞中的mRNA的相對表達水平；（E）過表達Nap1l5的水平檢測；（F）過表達Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標志物Anp、Bnp、Myh6在心肌細胞中的mRNA的相對表達水平；*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs Control（A）、Sham（B）、siNeg（C、D）、AdEGFP（E、F），P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs Control組。

鑒定結果解讀：

Ⅰ. 65#, 67#, 72#, 80#, 81#純合；

Ⅱ. 57#, 77#野生型；

1 項目策略圖

2 項目策略概述 利用 CRISPR/Cas9 技術，設計并體外轉錄 gRNA，將 Cas9、 gRNA 同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引導下結合到靶位點進而造成 DNA 雙鏈斷裂，從而實現靶位點堿基序列缺失，實現基因敲除。

3 gRNA 序列信息

4.構建PE誘導的心肌肥大細胞模型，檢測ArmH4過表達以及敲低后心肌肥厚分子標志物水平，分別提取總RNA，將內源性GAPDH的mRNA含量設為對照，通過qRT-PCR檢測心肌肥厚指標Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質性心臟疾病，主要表現為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發性，家族性病例和散發病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現：1.以青壯年多見、常有家族史。 2.可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現左心衰的表現。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點異丙腎上腺素及Valsalva動作后雜音增強，反之應用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區相對性二尖瓣關閉不全的收縮期雜音。 臨床診斷：超聲心動圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發心肌肥厚。二、模型背景1、Nap1l5基因信息? 敲除基因名稱（ NCBI 號）： Nap1l5（ 58243）敲除基因 NCBI 網址鏈接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58243敲除基因名稱（ MGI 號）： Nap1l5（ MGI: 1923555）敲除基因 Ensembl 網址鏈接：)，它們的印記狀態在人類和小鼠之間保存。在分子水平上，印跡基因由染色質標記的表觀遺傳標記控制，包括DNA甲基化或抑制組蛋白修飾，以沉默一個親本等位基因，從而導致單等位基因表達[4]。父母的沖突或親屬關系理論提出的摩爾和黑格表明[5],在哺乳動物中,父親一般地表達了印跡基因作用于胎盤促進萃取母親提高后代的資源開發和健身,而母親般地印跡基因表達行為限制保護產婦胎兒生長資源長期母親的生殖健康。印跡基因還可以通過影響細胞增殖或凋亡直接作用于胎兒，也可以通過影響母體營養物質通過胎盤的通量來影響胎兒生長。最近的證據也表明，印跡基因在認知行為中的作用，因為父系表達的Peg3基因失活研究表明，小鼠缺乏母性照料，從父親那里遺傳了一個空等位基因的雌性小鼠，會導致泌乳能力減弱，無法養育幼鼠[6]。一些實驗室的工作也表明，通過體細胞核移植克隆的動物的不完全表觀遺傳重編程導致印跡基因的異常表達，可能導致胎盤腫大[7, 8]。對這類基因的初步研究突出了其在一般生長發育中的重要作用[9]。最近，很明顯，這些基因也可能以一種高度特定的方式對大腦的發育和隨后的行為表型做出貢獻[10, 11]。 NAP1L5 (Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一種蛋白質編碼基因。與NAP1L5相關的疾病包括Beckwith-Wiedemann綜合征。該基因的一個重要同源基因是NAP1L1。可以影響身體的幾個部分。嬰兒和兒童在8歲之前通常都比正常身高要大，這時生長速度減緩，導致成人的平均身高。身體的癥狀可能包括一方或地區越來越比另一邊(不對稱增長或hemihyperplasia)、臍膨出或其他腹壁缺陷出生時,低血糖(低血糖)在嬰兒期,異常大的舌頭(巨舌),異常大的腹部器官,折痕或坑附近的皮膚的耳朵,和腎臟異常。受影響的兒童罹患腫瘤的風險更高，尤其是一種罕見的腎癌——Wilms腫瘤，一種肌肉組織癌——橫紋肌肉瘤，以及一種肝癌——肝母細胞瘤。然而，Nap1L5是否會參與免疫反應，影響炎癥作用，以及在結核病及心血管疾病中的功能及作用機制還有待我們進一步探究。參考文獻：1. Mcgrath, J. and D. Solter, Completion Of Mouse Embryogenesis Requires Both the Maternal And Paternal Genomes. Cell, 1984. 37(1): p. 179-183.2. Monk, D., et al., Limited evolutionary conservation of imprinting in the human placenta. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2006. 103(17): p. 6623-6628.3. Morison, I.M., J.P. Ramsay, and H.G. Spencer, A census of mammalian imprinting. Trends In Genetics, 2005. 21(8): p. 457-465.4. Lewis, A., et al., Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation. Nature Genetics, 2004. 36(12): p. 1291-1295.5. Moore, T. and D. Haig, Genomic Imprinting In Mammalian Development - a Parental Tug-Of-War. Trends In Genetics, 1991. 7(2): p. 45-49.6. Li, L.L., et al., Regulation of maternal behavior and offspring growth by paternally expressed Peg3. Science, 1999. 284(5412): p. 330-333.7. Mann, M.R.W., et al., Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned preimplantation stage mouse embryos. Biology Of Reproduction, 2003. 69(3): p. 902-914.8. Suemizu, H., et al., Expression profiling of placentomegaly associated with nuclear transplantation of mouse ES cells. Developmental Biology, 2003. 253(1): p. 36-53.9. Reik, W., et al., Imprinted genes and the coordination of fetal and postnatal growth in mammals. Novartis Found Symp, 2001. 237: p. 19-31; discussion 31-42.10. Davies, W., A.R. Isles, and L.S. Wilkinson, Imprinted genes and mental dysfunction. Ann Med, 2001. 33(6): p. 428-36.11. Isles, A.R. and L.S. Wilkinson, Imprinted genes, cognition and behaviour. Trends Cogn Sci, 2000. 4(8): p. 309-318.