Nipsnap2轉(zhuǎn)基因心肌肥厚小鼠模型

Nipsnap2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個(gè)總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應(yīng)用范圍廣，可以制造針對(duì)各類疾病不同組織器官細(xì)胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

鑒定結(jié)果：

圖1.Nipsnap1轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果鑒定圖。

1.策略示意圖

2.轉(zhuǎn)基因流程示意圖

一、疾病概述 病理性心肌肥厚（cardiac hypertrophy）是心肌細(xì)胞應(yīng)對(duì)高血壓、心肌梗死等因素所引起的心臟負(fù)荷超載的代償性改變，造成心肌重構(gòu)、心臟纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等病理性改變，這些復(fù)雜的反應(yīng)導(dǎo)致失代償?shù)男呐K重塑，如不能被及早診斷和干預(yù)，將不可逆轉(zhuǎn)地發(fā)展為心力衰竭，最終導(dǎo)致心源性猝死。臟通過持續(xù)泵送血液為身體提供氧氣和營養(yǎng)，是一種高耗能的器官。心臟能量代謝平衡是維持心臟正常生理功能的核心。深入研究心肌肥厚病理狀態(tài)下的生物學(xué)過程，有助于揭示心肌肥厚病理過程的分子機(jī)制，并為通過干預(yù)心肌肥厚的病理發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、模型背景1、Nipsnap2基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號(hào)）：14467? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 14467? 敲除基因名稱：Nipsnap2 nipsnap homolog 2? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000029432;r=5:129725063-129758327? 方案針對(duì)的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號(hào)）：ENSMUSG000000294322、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對(duì)放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對(duì)結(jié)核桿菌敏感。對(duì)鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對(duì)百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 該動(dòng)物模型的研究目的及意義；該動(dòng)物模型的國內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。迄今已鑒定4個(gè)NIPSNAP家族蛋白：NIPSNAP-1和-2以及NIPSNAP-3和-4。NIPSNAP家族蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：4-硝基苯磷酸酶域和非神經(jīng)性SNAP25類蛋白質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域。研究主要涉及癲癇發(fā)作，苯基酮尿癥，和阿爾茨海默病等。 NIPSNAP-2最初被確定為在大腦中表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放大序列。比對(duì)多個(gè)物種的NIPSNAP家族基因序列，揭示了NIPSNAP家族基因序列的高度保守性，提示其關(guān)鍵生物學(xué)功能。在氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)缺陷的患者中檢測(cè)到Nipsnap2的單核苷酸多態(tài)性(1)。人體內(nèi)Nipsnap2的突變與線粒體氧化呼吸鏈的電子傳遞功能相關(guān)(2)。Nipsnap2是神經(jīng)細(xì)胞L型鈣通道的正調(diào)節(jié)因子，Nipsnap2的過表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子CREB的激活增強(qiáng)以及幾種相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)增加(3)。在腫瘤發(fā)生過程中，Nipsnap2與EGFR表達(dá)協(xié)同上調(diào)，可能在腫瘤發(fā)生過程中參與了細(xì)胞內(nèi)的膜泡運(yùn)輸(4)。另有研究表明，HSP60促進(jìn)折疊，保持NIPSNAP-1和-2的穩(wěn)定性(5)。NIPSNAP-1和-2 在自噬中起著作用，它充當(dāng)ATG8s 的負(fù)調(diào)節(jié)器(6)。研究表明，線粒體基質(zhì)蛋白Nipsnap2在自噬過程累積在線粒體表面，通過招募蛋白質(zhì)，包括自噬受體和ATG8蛋白質(zhì)，參與選擇性自噬，為受損的線粒體發(fā)出‘eat me’的信號(hào)，從而發(fā)揮其保護(hù)功能(7)。參考文獻(xiàn)：1. Smits P, Rodenburg RJ, Smeitink JA, van den Heuvel LP. Sequence variants in four candidate genes (NIPSNAP1, GBAS, CHCHD1 and METT11D1) in patients with combined oxidative phosphorylation system deficiencies. J Inherit Metab Dis. 2010 Dec;33 Suppl 3:S13-9.2. Martherus RS, Sluiter W, Timmer ED, VanHerle SJ, Smeets HJ, Ayoubi TA. Functional annotation of heart enriched mitochondrial genes GBAS and CHCHD10 through guilt by association. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Nov 12;402:203-8.3. Brittain JM, Wang Y, Wilson SM, Khanna R. Regulation of CREB signaling through L-type Ca2+ channels by Nipsnap-2. Channels (Austin). 2012 Mar-Apr;6:94-102.4. Wang XY, Smith DI, Liu W, James CD. GBAS, a novel gene encoding a protein with tyrosine phosphorylation sites and a transmembrane domain, is co-amplified with EGFR. Genomics. 1998 May 1;49:448-51.5. Yamamoto S, Okamoto T, Ogasawara N, Hashimoto S, Shiraishi T, Sato T, Yamamoto K, Tsutsumi H, Takano K, et al. NIP-SNAP-1 and -2 mitochondrial proteins are maintained by heat shock protein 60. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Feb 12;483:917-22.6. Behrends C, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW. Network organization of the human autophagy system. Nature. 2010 Jul 1;466:68-76.7. Princely Abudu Y, Pankiv S, Mathai BJ, Hakon Lystad A, Bindesboll C, Brenne HB, Yoke Wui Ng M, Thiede B, Yamamoto A, et al. NIPSNAP1 and NIPSNAP2 Act as "Eat Me" Signals for Mitophagy. Dev Cell. 2019 May 20;49:509-25 e12.