Pxdc1基因敲除膿毒血癥小鼠模型

CLP成功建立膿毒血癥模型，結果表明與WT小鼠相比Pxdc1 雜合小鼠的炎癥指標IL-1β，TNF-α，MCP在Pxdc1 雜合小鼠肺部組織中表達呈下降趨勢，但需要進一步研究以闡明Pxdc1在肺部炎癥中的作用。

PVM為低于人間傳染病名錄三級安全風險的病原，人類感染的風險低，但不排除對免疫功能缺陷者的致病性。

PVM是嚙齒類實驗動物必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

通過雜合配雜合，繁育小鼠，統計Pxdc1對小鼠生育能力的影響。統計結果表明，Pxdc1敲除小鼠表現為純和致死，雜合子小鼠未出現生長發育異常（表1）。

表1.Pxdc1 KO小鼠F3代雜合*雜合繁育子代小鼠數量統計。

1. 膿毒血癥CLP模型結果 結果表明IL-1β，IL6，TNF-α，MCP在CLP處理后的野生型小鼠中mRNA表達量顯著增高，表明CLP膿毒血癥模型構建成功（圖1）。在Pxdc1缺失小鼠中，IL-1β，IL6，TNF-α，MCP的mRNA水平顯著提高。

圖1.Pxdc1缺失對膿毒血癥小鼠的影響。 2. 心肌肥厚模型 PE處理原代大鼠心肌細胞建立心肌肥厚細胞模型，過表達Pxdc1后檢測IL-6的mRNA水平，結果表明過表達Pxdc1促進IL-6的mRNA的表達。

圖2. 敲除Pxdc1加重PE所誘導的心肌肥厚水平。

1. 此模型采用CRISPR/Cas9技術對Pxdcl 基因進行基因編輯，原理示意圖如下：

2. CLP膿毒血癥模型：野生型和基因敲除小鼠麻醉后,腹部手術區常規消毒和去毛,分為假手術和手術組，無菌條件下用手術刀在腹壁作一長約2cm切口,經切口進腹，手術組在回盲瓣遠端分離并以3號絲線結扎1/3處盲腸，用20 G 套管針將盲腸盲端貫通穿孔2 次，回納腹腔，逐層縫合。

3. 將各實驗組小鼠心室肌組織分別提取總RNA，應用qRT-PCR檢測炎癥指標IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP的mRNA水平。、

4. 構建PE誘導的心肌肥大細胞模型，檢測ArmH4敲低后心肌肥厚分子標志物水平，分別提取RNA，通過qRT-PCR檢測炎癥指標IL-6的mRNA水平。

一、疾病概述 膿毒血癥作為臨床醫學較為常見的疾病之一, 是一種由感染誘發的一系列病理、生理以及生化異常的綜合征。其發病原因可能與下列因素有關:常發生于患有嚴重疾病或外傷的患者,還可常見于伴有慢性病或免疫力低下者 (如糖尿病、白血病以及再生障礙性貧血等)。其發病機制可能為:(1)病原體的外源性因子和損傷細胞釋放的內源性因子均可與機體的模式識別受體相互作用;(2)膿毒血癥炎癥與凝血的相互影響;(3)免疫細胞的自我程序性死亡;(4)機體在受到感染刺激后大量炎性介質的釋放。二、模型背景1、Pxdc1基因信息? 敲除基因名Pxdc1(NCBI：66895)? 除基因NCBI網址鏈接： https://www.ncbi.nIm.nih.gov/gene/66895? 敲除基因名稱(MGI號): Pxdc1(MGI: 1914145)? 敲除基因EnsembI 網址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000021411;r=13:34627841-34652681;t=ENSMUST00000125037? 方案針對的轉錄本（ Ensembl 號 ：ENSMUSG00000021411.16? 方案敲除的exon ：exon2- exon42、實驗動物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 膿毒血癥嚴重時可導致器官功能障礙或循環障礙,其預后效果較差, 具有高發病率、高病死率以及預后較差等特點[1]。在膿毒血癥病情進展過程中，細菌釋放的內毒素脂多糖(LPS)隨血液循環累積于肺組織，引發常急性肺損傷[2]。TNF-α和 IL-6等炎癥因子的檢測水平為判斷膿毒血癥嚴重程度和疾病愈后的重要指標[3,4]。膿毒血癥模型最經典的方法是盲腸結扎穿刺法（CLP），為研究膿毒血癥的金標準[5]。 Pxdc1是一個印跡基因，位于6號染色體上。印跡基因是一個以親本來源的等位基因特異性沉默為特征的一類基因[6]。在人類中，已鑒定出大約105個印跡基因座，其中許多在發育和生長中起著重要作用，印跡基因或區域的失調可導致多種疾病，例如Prader-Willi或Angelman綜合征[7]。印記基因的表達紊亂還與多種癌癥的發生相關聯，例如胰島素樣生長因子 2 基因(insulin like growth factor 2, IGF2)的印記丟失會導致乳腺癌等癌癥的發生[8]。在C57BL / 6小鼠中，TCDD激活AhR后，Pxdc1蛋白表達明顯被抑制，AhR轉錄調控Pxdc1的表達，并且下調的Pxdc1蛋白可能參與TDCC導致的炎癥反應[9]。我們構建Pxdc1 C57BL / 6敲除小鼠，并且建立C57BL / 6雄性和Pxdc1雜合雄性小鼠盲腸結扎穿刺法 (CLP)建立膿毒血癥模型，肺部組織QPCR檢測炎性因子，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β），驗證是否Pxdc1調節機體的免疫反應，特別是感染導致的炎癥性疾病。參考文獻：1 Charchaflieh J, Wei J, Labaze G, et al. The role of complement system in septic shock. Clin Dev Immunol.2012,2012:407324.2 張婷,王祥瑞.膿毒血癥休克的液體治療[J].上海醫藥.2011,34(10):796.3 Celebi D, Aydin P, Cinar I, et al. Protective effect of luteolin on acute lung injury in a rat model of sepsis. Biotech Histochem.2020:1-7.4 Kabay B, Kocaefe C, Baykal A, et al. Interleukin-10 gene transfer: Prevention of multiple organ injury in a murine cecal ligation and puncture model of sepsis. World J Surg.2007,31(1):105-15.5 Medina E. Murine model of polymicrobial septic peritonitis using cecal ligation and puncture (clp). Methods Mol Biol.2010,602:411-5.6 Falls J G, Pulford D J, Wylie A A, et al. Genomic imprinting: Implications for human disease. Am J Pathol.1999,154(3):635-47.7 Peters J. The role of genomic imprinting in biology and disease: An expanding view. Nat Rev Genet.2014,15(8):517-30.8 Pan Y, He B, Lirong Z, et al. Gene therapy for cancer through adenovirus vectormediated expression of the ad5 early region gene 1a based on loss of igf2 imprinting. Oncol Rep.2013,30(4):1814-22.9 Prokopec S D, Lu A, Lee S C S, et al. Comparative toxicoproteogenomics of mouse and rat liver identifies tcdd-resistance genes. Arch Toxicol.2019,93(10):2961-2978.