帕金森病斑馬魚模型

更新時間：2025-07-12 來源：健明迪檢測

健明迪檢測提供的帕金森病斑馬魚模型，討論與結論 1.動物癥狀觀察與野生型斑馬魚相比，斑馬魚幼體暴露于MPTP后，出現類似人類PD患者的行走不穩、反應遲緩、靜止性震顫，具有CMA，CNAS認證資質。

討論與結論

1. 動物癥狀觀察與野生型斑馬魚相比，斑馬魚幼體暴露于 MPTP 后，出現類似人類 PD 患者的行走不穩、反應遲緩、靜止性震顫。PD 模型斑馬魚的游泳速度明顯變緩，泳速和游泳持續時間明顯減低，甚至靜止時伴有身體抖動，對觸及刺激反應遲緩且反應強度減低（圖 1）。與臨床癥狀相符。

2. 生物標志物方面：PD 的蛋白標志物 β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1 明4顯高于正常對照斑馬魚；神經元細胞標志物酪氨酸羥化酶蛋白(TH)明顯減少，提示多巴胺能神經元細胞死亡數增多（圖 1）。

3. 多巴胺能神經元細胞數量明顯減少。但，神經元細胞內 th 基因表達強度增強，類似于人 PD 早期腦多巴胺神經元死亡后存活神經元的代償性 TH 高表達。（圖 2）

圖1. MPTP造成斑馬魚幼體運動減少，PD標志基因/蛋白水平升高斑馬魚幼體(5 dpf)暴露于50 μM的MPTP中24小時，進行運動活性（運動距離、持續時間和速度）檢測20分鐘。A．散點圖顯示幼體運動行為的統計學變化；右側顯示一組代表性運動軌跡圖(5分鐘軌跡)。B–E, 斑馬魚暴露于100和200 μMMPTP 24小時后，檢測PD相關的標志基因和蛋白: TH (B)、β-syn (C)、Parkin (D)和PINK1 (E)。*, p values_0.05; **, p values_0.01; ***, p values_0.001。(one-wayANOVA)。

圖 2. MPTP 導致斑馬魚幼體中腦多巴胺能神經元數量減少A. 以酪氨酸羥化酶基因(th)反義 RNA 為探針，采用原位雜交方法檢測斑馬魚幼體中腦多巴胺神經元數量和 th 基因表達強度。B. 原位熒光免疫實驗檢測酪氨酸羥化酶，綠色熒光斑點顯示斑馬魚幼體中腦多巴胺神經元數量和分布。一抗抗體為酪氨酸羥化酶抗體。

生物安全性

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

評價驗證

（1）癥狀觀察斑馬魚幼體（6 dpf）行為: 考察、記錄其游泳速度和姿態、持續時間、運動距離；靜止時身體平衡情況、有無顫抖等。

（2）生物標志物檢測斑馬魚暴露于 MPTP 中持續 24 小時，收集幼體，提取總 RNA 和蛋白，進行 RT-PCR 和 Western blotting 檢測 PD 相關的基因和蛋白：TH、β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1。

（3）病理診斷采取原位雜交和原位免疫熒光方法，檢測斑馬魚中腦/間腦多巴胺神經元的數量和分布變化。

制備方法

1. 造模化合物1-甲基－4－苯基－1,2,3,6－四氫吡啶（MPTP）是一種神經毒素，常用于制作帕金森病動物模型。2. 實驗動物野生型斑馬魚 AB 或 TU 品系。斑馬魚飼養和管理均按照常規方法。飼養空間溫度 28-30°C。3. 造模化合物處理MPTP 為 Sigma (M0896) 產品，MPTP 母液用純水制備，濃度為100 μM，儲存于－20 °C. MPTP工作液用飼養液稀釋至50、100、200、500 μM。將斑馬魚2幼體暴露于MPTP 工作液24小時，收集幼體，進行下一步處理。4. RT-PCR檢測PD相關基因轉錄水平

收集斑馬魚于 TRIzol reagent (Sigma).提取總 RNA，進行 RT-PCR 檢測 PD相關的基因表達水平。PCR 引物見表 1。

5. 原位RNA雜交收集斑馬魚于4% paraformaldehyde固定。Th基因探針片段為PCR產物（表1），并被克隆到載體pGEM-T質粒上。探針的合成按照試劑盒(DIG RNA labeling kit(Roche Applied Science, 1175041)）說明制備th基因RNA雜交探針。按照操作程序將斑馬魚樣本與探針溫育、檢測、拍照。

6. 原位免疫熒光檢測按照常規程序，將斑馬魚幼體與TH蛋白單克隆抗體(Minipore, MAB318)溫育，然后用FITC-標記的二抗溫育、洗滌，顯微鏡下檢測、拍照。

7. Western blotting用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑馬魚總蛋白，進行SDS-PAGE、轉膜，用PD相應蛋白的抗體和二抗進行檢測。β-ACTIN抗體，3mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonalantibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no.6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAbantibody (CST, catalog no. 2644)。

8. 斑馬魚行為學實驗幼體行為記錄采用ZebraLab (法國Viewpoint, ZebraLab 3.3)儀器，幼體逐個放入96-孔板，(1 fish/well). 記錄運動距離、游泳持續時間、速度和游泳軌跡。每5分鐘記錄一次數據。

研究背景

一、疾病名稱帕金森疾病 (Parkinson’s disease, PD)二、臨床發病機制及癥狀帕金森疾病是中老年人的慢性神經系統退行性疾病，發病年齡在 40－70 歲之間。PD 發病與以下因素相關：1.腦老化，隨人的增齡，黑質多巴胺能神經元不斷死亡，當 80％的神經元死亡時可出現 PD 癥狀。2. 具有遺傳性，a-突觸核蛋白及 Parkin 等基因突變與少數家族性 PD 相關。3.環境因素，一些外源性或內源性毒素可引起黑質紋狀體神經元死亡，如海洛因吸食者出現 PD 樣癥狀，后者被證實含有神經毒素 MPTP。4. 其它疾病和外傷導致的腦神經損傷，如腦梗等腦血管病變和創傷導致的腦神經元死亡。臨床 PD 主要有 4 大癥狀：靜止性震顫、運動緩慢或少動、肌強直及姿態平衡障礙。