ddx18 基因敲除斑馬魚白血病模型

動物癥狀觀察：

表現為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

1. 外周血涂片檢測 ddx18 基因缺失對血液白細胞類型的影響取 WT 和 DDX18 敲除的斑馬魚成魚外周血涂片，進行非紅細胞分類計數和細胞形態分析（圖 1 A、1C）?；?ddx18 缺失的斑馬魚外周血細胞與正常魚比較，原始粒細胞和幼稚粒細胞明顯增多，血栓細胞略有減少（圖 1 B，圖 1 D），表明 ddx18 敲除的斑馬魚具有髓系白血病的特征。

2. 免疫印跡方法檢測 ddx18 基因缺失對斑馬魚血液發生標志蛋白的影響 以 WT 型斑馬魚為對照，檢測血細胞發育相關基因，結果顯示，敲除 ddx18 基因后，限定性血液干細胞(Definitive HSC)標志蛋白 C-MYB 和 CD41 和血栓細胞標志蛋白 TPO 水平明顯升高，而髓系標志蛋白 G-CSF 的短型同源物缺失（圖 2）。這些結果證明 ddx18 基因缺失可影響髓系早期血細胞的發育。

圖 1. 野生型與 ddx18 基因敲除斑馬魚血細胞形態學分析A: 野生型斑馬魚外周血細胞分型; B：野生型斑馬魚外周血細胞分類計數；C: ddx18 基因敲除斑馬魚外周血細胞分型；D：ddx18 基因敲除斑馬魚的外周血細胞分類計數。

圖 2. 野生型與 ddx18 基因敲除斑馬魚的血細胞標志蛋白

1. ddx18 基因敲除斑馬魚的制備 委托基因公司采取基因編輯技術制備 ddx18 基因敲除的 F0 代雜合子斑馬魚 3 條。

2. ddx18 基因敲除斑馬魚的驗證將獲得的 F0 代雜合子斑馬魚進行交配，獲得 F1 代胚胎。將 F1 胚胎按常規飼養至性成熟，取 3-4 月齡的 F1 成魚，編號、剪取部分尾鰭，提取基因組 DNA，克隆相關基因片段、測序鑒定基因型，篩選基因組 ddx18 敲除的突變體。

3. 攜帶 ddx18 突變等位基因的 F2 突變體的篩選鑒定將 ddx18 敲除的 F1 代雌雄斑馬魚繼續交配，獲得 F2 代，待其性成熟后，同上，2取 F2 代成體斑馬魚少量尾鰭，提取基因組 DNA，利用 ddx18 特異性引物進行 PCR擴增，測序鑒別 ddx18 敲除成功的斑馬魚進一步繁殖、或用于后續實驗。Ddx18 基因表達檢測：根據該基因 mRNA 設計引物，取 F2 代幼體，采用 RT-PCR 檢測 ddx18 基因轉錄產物，并測序驗證其產物突變或缺失。

4. 模型分析指標

（1）外周血涂片檢測 ddx18 基因缺失對血液細胞類型的影響取 3-4 月齡野生型和 ddx18 基因缺失的斑馬魚外周血涂片、瑞氏-姬姆薩復合染液染色，進行非紅細胞分類計數（包括原始粒細胞、幼稚粒細胞、桿狀中性粒細胞、分葉中性粒細胞、血栓細胞、淋巴細胞和單核細胞）和細胞形態分析。

（2）免疫印跡計數檢測 ddx18 基因缺失對斑馬魚血液發生標志蛋白的影響取不同“家系”的 ddx18 敲除的斑馬魚幼體（5 dpf）（野生型 5 dpf 斑馬魚幼體做對照），提取總蛋白，Western Blot 檢測血液發生標志蛋白 C-myb，Thrombopoietin，G-CSF，CD41 蛋白水平。

一、 疾病名稱

遺傳性粒性白血病 (Hereditary Myeloid Leukemia)

二、 臨床發病機制及癥狀

白血病是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，其特點是在骨髓和其他造血組織中白血病細胞廣泛而無控制地增生，并浸潤、破壞全身各組織器官。造血細胞的某一系列、主要是某一白細胞系列的前體細胞失去分化成熟能力，在骨髓中和其他造血組織中呈惡性克隆性增生、積聚，并侵犯肝、脾、淋巴結，最終浸潤破壞全身組織、器官，使正常造血功能受到抑制。白血病會導致正常造血功能受抑制，外周血出現幼稚細胞。臨床上常有貧血、發熱、出血和肝脾淋巴結不同程度腫大等表現。一般而言，大多數白血病屬于獲得性疾病。然而研究表明，一些家族染色體可能帶有血液病的易感基因，即此類易感基因使人更容易患上白血病。新近臨床研究發現一些粒性白血病病人攜帶有 ddx18（DEAD-box 18）基因的突變；動物實驗證明該基因與粒性血細胞發育相關。DDX18 蛋白是一種高度保守的 RNA 解螺旋酶。斑馬魚 ddx18 基因位于斑馬魚 9 號染色體上；其 DDX18 蛋白序列與人類 DDX18 序列有 72%的同源性。

三、 模式動物

斑馬魚 TU 系。