耳功能損傷斑馬魚模型

該模型通過埋植雌激素，進而建立了皮膚型狼瘡動物模型，主要是檢測其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，創(chuàng)新點在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機制提供了工具。目前國際無報道。

無安全性問題。

1. 動物癥狀及病理觀察在藥物處理、撤藥 2 天后，以耳石周圍的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個部位的神經(jīng)丘毛細胞作為主要觀察對象，發(fā)現(xiàn)這五個部位的神經(jīng)丘毛細胞均有不同數(shù)量的減少，同時側(cè)線神經(jīng)丘和毛細胞也有不同程度的減少（圖 1）；此外，處理組幼體的半規(guī)管和耳石結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常：卵圓囊變?yōu)閳A形，而圓囊變小且不規(guī)則（圖2）。另外，幼體的身體姿態(tài)靜止時失衡（圖 3）。這些癥狀均與人的位聽功能損害表現(xiàn)相似。

圖 1. 慶大霉素對毛細胞的損傷(7 dpf)斑馬魚頭部和測線排列的神經(jīng)丘主要由“花瓣樣”排列的數(shù)個毛細胞組成。綠色熒光點顯示神經(jīng)丘內(nèi)的毛細胞。

圖 2. 三種氨基糖苷類藥物對斑馬魚半規(guī)管和耳囊結(jié)構(gòu)的損傷(5 dpf)

圖 3. 三種氨基糖苷類藥物處理導(dǎo)致斑馬魚幼體(5 dpf)身體姿態(tài)失衡5三種氨基糖苷類抗生素作用于斑馬魚胚胎發(fā)育期，雖然孵化后撤除了藥物，但幼體仍顯現(xiàn)出嚴重的毛細胞損傷和數(shù)量減少，以及神經(jīng)丘缺失和排列紊亂。說明這種耳毒性損傷難以恢復(fù)。2. 基因表達異常進一步檢測早期聽覺器官發(fā)育的四個重要基因 eya1、val、otx2、dlx6a 的表達水平，結(jié)果顯示這三種氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致這些基因在 48 hpf 胚胎的表達水平不同程度的下降。推測這些基因的下調(diào)可能與斑馬魚幼體內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育的缺陷及聽力缺陷相關(guān)（圖 4）。

圖 4. 三種氨基糖苷類藥物處理對斑馬魚耳發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

1. 實驗動物

野生型斑馬魚 AB 或 TU 品系 5 dpf 幼體。斑馬魚的位聽覺器官由相當(dāng)于哺乳動物內(nèi)耳的耳囊及其附屬結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括神經(jīng)丘(有數(shù)個位于中心的毛細胞和圍繞在周圍的支持細胞構(gòu)成)、半規(guī)管和兩個耳囊（橢圓囊和圓囊，相當(dāng)于人的卵圓窗和圓窗），其功能與人類內(nèi)耳相同。另外，在斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)上的神經(jīng)丘毛細胞也具有位覺功能。斑馬魚 5-dpf 幼體直到成年，其對聲音的刺激域和頻寬是不變的。因此，斑馬魚的位聽覺器官是研究位聽覺的理想模型。

2. 造?；衔锛捌鋵Π唏R魚的處理

造模藥：氨基糖苷類藥物：慶大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)和鏈霉素(Streptomycin)。三種造模藥通過預(yù)實驗確定給藥濃度梯度。均使用人工海水直接配置。將發(fā)育至 6 hpf 的斑馬魚胚胎暴露于上述三種氨基糖苷類藥液中，直至 72 hpf。撤去藥液，用正常飼養(yǎng)液清洗斑馬魚后，繼續(xù)發(fā)育至 5、6 dpf，進行后續(xù)處理。

3. 模型分析指標(biāo)

（1） 癥狀觀察斑馬魚身體平衡失調(diào)和體位異常與其位覺功能損傷相關(guān)。正常斑馬魚的 5 dpf幼體靜止時體位為俯位。斑馬魚幼體在靜止時呈斜側(cè)位，或游動姿態(tài)異常，均為體位失衡。

（2） 毛細胞損傷檢測取野生型和造模藥處理的斑馬魚幼體（6 dpf），分別浸入活體熒光染料 1 μMYo-Pro-1（Invitrogen）的人工海水中避光孵化 1 小時，將斑馬魚用人工海水洗三次，再將胚胎置于麻醉劑 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonatesalt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉后在熒光顯微鏡下觀察毛細胞形態(tài)、數(shù)量和排列，并拍攝、計數(shù)。

（3） 病理診斷顯微鏡下觀察活體幼體耳結(jié)構(gòu)的變化，包括半規(guī)管和耳囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。以同批野生型斑馬魚幼體為正常對照組，藥物處理組撤藥 2 天后，以耳石周圍的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個部位的神經(jīng)丘毛細胞作為主要觀察對象，結(jié)合側(cè)線神經(jīng)丘和毛細胞的觀察、計數(shù)。以神經(jīng)丘毛細胞數(shù)量減少和毛細胞結(jié)構(gòu)異常為病理診斷指標(biāo)。

（4）基因檢測RT-PCR 方法檢測聽覺發(fā)育基因的轉(zhuǎn)錄水平：收集野生型和藥物不同濃度處理胚胎各 40 枚, 用 Trizol 提取總 RNA; 以 AMV 反轉(zhuǎn)酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 3Co.) 合成 cDNA1st 模板；進行常規(guī) PCR。以 β-actin 基因作為內(nèi)參基因。PCR產(chǎn)物電泳, 凝膠成像分析儀拍照記錄。

一、疾病名稱

聽力損傷 (Hearing impairment)

二、臨床發(fā)病機制及癥狀

耳功能損傷臨床癥狀主要有眩暈、平衡失調(diào)和耳鳴、耳聾。耳是人和脊椎動物的聽覺和平衡器官。內(nèi)耳和毛細胞是執(zhí)行這兩功能主要器官和細胞。人的內(nèi)耳包括前庭、半規(guī)管和耳蝸三部分。前庭和半規(guī)管是位覺感受器，負責(zé)感受體位和調(diào)節(jié)身體平衡；而耳蝸是聽覺感受器，與聽力相關(guān)；以及在它的外壁的兩個耳斑：卵圓窗和圓窗。位覺感受器受損的表現(xiàn)為眩暈、惡心、平衡失調(diào)和步態(tài)不穩(wěn)。聽覺感受器受損的表現(xiàn)為耳聾。其損害的直接靶位為內(nèi)耳組織器官的毛細胞。藥物耳毒性是指藥物導(dǎo)致的內(nèi)耳損傷，這種損傷可以發(fā)生在耳蝸，前庭或/和聽神經(jīng)。藥物耳毒性可以是可逆性的如阿司匹林等，也可導(dǎo)致永久性耳聾如氨基糖苷類和一些抗癌藥如卡鉑，順鉑等。有研究報道，我國約 100 萬以上的聾啞兒童中 2/3 是濫用耳毒性藥物所致。大量的調(diào)查數(shù)據(jù)和研究報道證實，氨基糖甙類抗生素藥物的耳毒性致聾不僅位于國內(nèi)藥物致聾的首位，而且是導(dǎo)致新生兒先天和后天性耳聾以及成人耳聾的各種致聾因素排位之首。

三、模式動物

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。