瘦素受體敲除II型糖尿病大鼠模型

該模型通過長期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時，檢測其dsDNA等，結合皮膚癥狀變化，來確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，為研究狼瘡皮膚病發病機制提供了工具。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

Western blot顯示，該大鼠無法正常表達功能性完整的瘦素受體蛋白。

1. 肥胖 瘦素受體敲除大鼠（Lepr-/-）與野生大鼠相比攝食量和體重都顯著增加，1月齡時雄性瘦素受體敲除大鼠比野生大鼠體重增加60%，8月齡時雌性瘦素受體敲除大鼠比雄性大鼠更加肥胖，比同齡同性別野生大鼠體重增加了160%（圖2）

圖2 瘦素受體敲除大鼠體重增加 圖A，8月齡瘦素受體敲除大鼠和野生大鼠的比較； B和C, 1-8月齡雄性和雌性瘦素受體敲除大鼠和野生大鼠的體重曲線。 2. 雄性瘦素敲除大鼠空腹血糖和隨機血糖值增加

雄性瘦素敲除大鼠的空腹血糖從4月齡開始至8月齡都顯著高于野生大鼠，隨機血糖值從2月齡開始至8月齡顯著高于野生大鼠，其中4月齡時是野生大鼠血糖值的1.64倍，這種現象在雌鼠中沒有觀測到。

圖3 瘦素受體敲除大鼠和野生大鼠空腹及隨機血糖的比較A和B，瘦素受體敲除大鼠雄鼠和雌鼠空腹血糖與野生大鼠的比較；C和D，瘦素受體敲除大鼠雄鼠和雌鼠隨機血糖與野生大鼠的比較 3 胰島素抵抗和高胰島素血癥 瘦素敲除大鼠在2月齡，4月齡和8月齡的糖耐受實驗顯示明顯的胰島素抵抗和高胰島素血癥，隨著月齡的增加胰島素抵抗更加顯著（圖4）。

圖4 2，4，8月齡瘦素受體敲除大鼠和野生大鼠的糖耐受曲線及葡萄糖刺激下的胰島素曲線A和B, 2，4，8月齡瘦素受體敲除大鼠和野生大鼠的糖耐受曲線C和D, 2，4，8月齡瘦素受體敲除大鼠和野生大鼠的胰島素曲線5.4 瘦素受體敲除大鼠胰島細胞增生及組織的脂肪沉積 病理切片觀察到瘦素受體敲除大鼠有增生的胰島，肝臟細胞中有脂肪沉積和空泡化的現象（圖5）。

圖5 病理觀察瘦素受體敲除大鼠的胰腺和肝臟組織 4 瘦素敲除大鼠出現高脂血癥 2，4，8月齡瘦素敲除大鼠外周血血生化分析顯示，甘油三酯，總膽固醇，高密度膽固醇都顯著高于同齡野生大鼠， 8月齡時低密度膽固醇也顯著升高。表1， 2，4，8月齡瘦素敲除大鼠和野生大鼠的血生化分析

CHO, 總膽固醇; TG, 甘油三酯; HDL, 高密度脂蛋白; LDL, 低密度脂蛋白.* P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001

利用CRISPR/Cas9技術制備瘦素受體（Leptin receptor）基因敲除大鼠，獲得一個在瘦素受體所在基因組上從90043bp to 90341bp位置缺失 298-bp堿基，并插入了4個堿基，在瘦素受體基因序列上產生了終止密碼子TGA，在蛋白水平上來看共缺失了997個氨基酸。Western blot顯示，該大鼠無法正常表達功能性完整的瘦素受體蛋白。

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點，典型病例可出現多尿、多飲、多食、消瘦等表現，即“三多一少”癥狀，糖尿病(血糖)一旦控制不好會引發并發癥，導致腎、眼、足等部位的衰竭病變，且無法治愈。糖尿病(Diabetes)分1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類型的糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占的比例約為95%。2型糖尿病原名叫成人發病型糖尿病，多在35～40歲之后發病。

2 型糖尿病有更強的遺傳性和環境因素，并呈顯著的異質性。目前認為發病原因是胰島素抵抗(主要表現為高胰島素血癥，葡萄糖利用率降低)和胰島素分泌不足的合并存在，其表現是不均一的，有的以胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌不足，有的則是以胰島素分泌不足伴有或不伴有胰島素抵抗。胰島素是人體胰腺B細胞分泌的身體內唯一的降血糖激素。胰島素抵抗是指體內周圍組織對胰島素的敏感性降低，外周組織如肌肉、脂肪對胰島素促進葡萄糖的吸收、轉化、利用發生了抵抗。臨床觀察胰島素抵抗普遍存在于2型糖尿病中，高達90%左右。2型糖尿病可導致感染、心臟病變、腦血管病變、腎功能衰竭、雙目失明、下肢壞疽等而成為致死致殘的主要原因。糖尿病高滲綜合癥是糖尿病的嚴重急性并發癥，初始階段可表現為多尿、多飲、倦怠乏力、反應遲鈍等。隨著機體失水量的增加病情急劇發展，出現嗜睡、定向障礙、癲癇樣抽搐，偏癱等類似腦卒中的癥狀，甚至昏迷。