Leptin敲除肥胖癥大鼠模型

該模型通過長期觀察普通狼瘡小鼠模型，待其到40周齡時，檢測其dsDNA等，結合皮膚癥狀變化，來確定慢性狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，為研究狼瘡皮膚病發病機制提供了工具。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統?？諝饨涍^初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

1 Leptin敲除大鼠表現肥胖表型

從出生后1月齡始, Leptin敲除大鼠比野生大鼠表現出現顯著的體重增加，1月齡Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩大鼠（Leptin+/+）分別增加了27%和37%，到3月齡時Leptin-/-雌、雄鼠體重比同窩大鼠（Leptin+/+）增加了38%和39%，6月齡、8月齡時Leptin-/-雌鼠體重是同窩大鼠（Leptin+/+）的2.3倍，6月齡、8月齡時Leptin-/-雄鼠的體重是同窩大鼠（Leptin+/+）的1.8倍和2.0倍(見圖1C和圖1D)。MRI結果也觀察到Leptin-/-大鼠皮下和腹腔脂肪積累的增加（圖1B）。麻醉處死4月齡大鼠，剝離皮下及腹腔脂肪并稱重，證實Leptin-/-大鼠的皮下和腹腔脂肪的重量分別是Leptin+/+大鼠的20倍和4倍。

圖2 Leptin敲除(Leptin-/-)大鼠表現肥胖。

A：6月齡Leptin+/+大鼠（左）和Leptin-/-大鼠（右）。 B，Leptin-/-大鼠MRI分析,白色部分為高反射的脂肪組織。C：1-8月齡的雌性Leptin+/+（n=5）及Leptin-/- 大鼠（n=5）的體重變化。D：1-8月齡的雄性Leptin+/+（n=4）及Leptin-/- 大鼠（n=2）的體重變化。*，p<0.05。

2 Leptin敲除大鼠肝臟中大量脂肪沉積

取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠肝臟固定，石蠟包埋及切片，HE染色觀察結果顯示，4月齡 Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比，沒有明顯的病理變化，8月齡 Leptin-/-大鼠肝臟肝小葉中出現大量脂肪空泡，提示肝細胞脂肪變性。

圖3 Leptin-/-大鼠肝臟組織脂肪變性（40×）。

4M ,4月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）； 8M ，8月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

3 雌性Leptin敲除大鼠空腹血糖升高

比較出生后1月齡至8月齡，Leptin+/+雌鼠和Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值（見圖2）。雌鼠自1月齡起，Leptin-/-大鼠的空腹血糖值就顯著高于Leptin+/+大鼠（40%），3月齡比Leptin+/+大鼠高33%，6月齡血糖降低但仍然比Leptin+/+大鼠高26%，8月齡時比野生大鼠高出11%，高血糖表型可以維持5個月以上。雄性Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠的空腹血糖值沒有顯著差異。

圖4 Leptin-/-基因敲除大鼠空腹血糖受損。

1,3,6,8月齡的雌性Leptin-/-大鼠（n=5）及Leptin+/+大鼠（n=5）的空腹血糖變化。*，p<0.05。

4 Leptin敲除大鼠出現明顯的胰島素抵抗

4月齡時，對Leptin-/-大鼠進行糖耐受實驗(圖4a)和胰島素耐受實驗(圖4b)，測定結果顯示4月齡的Leptin-/-大鼠就出現了明顯的高胰島素血癥及胰島素抵抗的癥狀。

圖5，4月齡Leptin-/-大鼠的糖耐受曲線和葡萄糖刺激下的胰島素曲線

Leptin-/-大鼠和Leptin+/+的腹腔糖耐受曲線(n=5)；b，葡萄糖刺激下的胰島素曲線(n=5)；

5 Leptin敲除大鼠胰島增生

取材4、8月齡雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠的胰腺組織固定，石蠟包埋及切片，H&E染色觀察基因敲除大鼠胰腺病理學變化（見圖4）。結果顯示，6月齡 Leptin-/-大鼠與Leptin+/+大鼠相比，胰島體積增大，但是數量增多不明顯，且胰腺也沒有脂肪細胞浸潤，而8月齡Leptin-/-大鼠胰島數量明顯增多，體積增大更顯著，胰腺內較多脂肪細胞浸潤，胰島形態由于快速擴張而極不規則。胰島素抗體免疫組化顯示，4、8月齡Leptin-/-大鼠β細胞增多，胰島素分泌大大增加（見圖5）。

圖6 Leptin-/- 大鼠胰腺組織胰島病理學觀察。

4M,4月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）； 8M ，8月齡雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

瘦素基因(Leptin)敲除大鼠

背景品系為SD(Sprague Dawley, SD)大鼠，為大鼠（rat；rattus norregicus）的一個品系，屬于動物界、脊索動物門、脊椎動物亞門、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、大家鼠屬（Genus Rattus）、大家鼠種（Speciesrattus norvegicus）的動物，1925年，美國斯潑累格?多雷（Sprague Dawley）農場用Wistar大鼠培育而成。

利用TALENs和顯微注射技術,獲得一只在Leptin編碼區418- 425位堿基缺失的大鼠，由于同時產生了TGA終止密碼子(圖1b)，導致該蛋白C末端缺失了28個氨基酸。

圖1 western blot檢測Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠肝臟中leptin的表達。

一、疾病名稱

肥胖癥(obesity)是一種由多種因素引起的慢性代謝性疾病,以體內脂肪細胞的體積和細胞數增加,從而導致體脂占體重的百分比異常增高并在某些局部過多沉積脂肪為特點,早在1948年,WHO已將肥胖癥列入疾病分類名單,2000年,WHO將吸煙,肥胖和艾滋病列為人類的三大殺手。

二、疾病臨床表現及致病機制

肥胖癥可以引發生理,心理和社會問題,已證實肥胖癥是心腦血管疾病, 胰島素抵抗, 2型糖尿病,某些癌癥的重要危險因素。

（1）肥胖癥與心血管系統肥胖癥患者并發冠心病、高血壓的幾率明顯高于非肥胖者，其發生率一般5～10倍于非肥胖者，尤其腰臀比值高的中心型肥胖患者。

（2）肥胖癥的糖、脂代謝進食過多的熱量促進三酰甘油的合成和分解代謝，肥胖癥的脂代謝表現得更加活躍，相對糖代謝受到抑制，這種代謝改變參與胰島素抵抗的形成。肥胖癥脂代謝活躍的同時多伴有代謝的紊亂，會出現高三酰甘油血癥、高膽固醇血癥和低高密度脂蛋白膽固醇血癥等。糖代謝紊亂表現為糖耐量的異常甚至出現臨床糖尿病

（3）肥胖癥與胰島素抵抗體脂堆積可引起胰島素抵抗、高胰島素血癥。

（4）其他肥胖者嘌呤代謝異常，血漿尿酸增加，使痛風的發病率明顯高于正常人，伴冠心病者有心絞痛發作史。肥胖者血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇常升高，高密度脂蛋白膽固醇降低，易導致動脈粥樣硬化。由于靜脈循環障礙，易發生下肢靜脈曲張、栓塞性靜脈炎、靜脈血栓形成。