KM突變慢性炎癥小鼠模型

該模型通過埋植雌激素，進而建立了皮膚型狼瘡動物模型，主要是檢測其dsDNA，腎臟變化，結合皮膚癥狀變化，來確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，創新點在于該模型可快速建立模型，屬于誘導性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發病機制提供了工具。目前國際無報道。

無安全性問題。

（一）KM突變小鼠的遺傳特征

KM自發突變小鼠雄鼠F0與KM野生雌鼠交配得到表型正常的F1代；F1代雌雄互交得到F2代，有突變小鼠出現。目前F2代小鼠總數為227只，突變總數為65只（雌性37只，雄性28只），突變小鼠出現率為28.6%，突變雌雄的比例約為1:1；F2代突變雄鼠再與F1代雌性小鼠交配得到F3代，F3代有突變小鼠出現，F3代小鼠總數為204只，突變小鼠96只（雌性45只，雄性51只），突變小鼠出現率為47.1%，雌雄比例約為1:1；F3代突變雄鼠與表型正常雌性小鼠同窩交配得到F4代，F4代小鼠共174只，突變小鼠91只（雌性47只，雄性44只），突變小鼠出現率為51.7%，突變雌雄比例約為1:1。通過回交及測交實驗表明KM突變小鼠出現率不受性別限制，突變基因不在性染色體上，進而得到KM突變小鼠皮膚及毛發性狀的遺傳規律可能是單基因控制的常染色體隱性遺傳，與性別無關，符合孟德爾遺傳規律（分離規律）。自F3代開始同窩兄妹互交至20代建立近交系KM突變小鼠品系。以F5-F8代為例，F5-F8代突變小鼠的出現率分別為50%、46.9%、51.3%和46.2%，且均無性別差異。（遺傳培育結果見表1，表2，匯總表3）

表1回交結果

表2 F1, F3-F8代同窩突變雄鼠與表型正常雌鼠測交結果

表3 KM突變小鼠的近交系培育結果

（二）模型的皮膚特征：

從外部表型來看，與野生型KM小鼠相比，該突變小鼠在出生1-5天觀察不到明顯異常，至6-7天被毛長出后可與野生鼠區分開，野生型小鼠全身由發育良好的被毛覆蓋，除爪、耳和尾之外全身呈白色外觀；而突變小鼠被毛稀少不能覆蓋全部皮膚，故保持粉紅色外觀直至離乳。成年后突變小鼠被毛稀疏，有部分小鼠頸背部、眼眶周圍出現脫毛，隨年齡增長逐漸消瘦，皮膚松弛，頸背部皮褶增多，偶有皮屑出現，部分小鼠的頸前部和肩胛部皮膚出現潰瘍，伴有局部淋巴結增大。(圖1)

圖1 a.新生 KM野生小鼠（1天）b.新生KM突變小鼠（1天），兩者無明顯差別；c.新出生KM野生小鼠（6天），乳白色皮膚d.新出生KM突變小鼠（6天），體型小，粉紅色皮膚，可與同齡野生小鼠辨別e.（3月）突變小鼠被毛稀疏，皮膚干燥、皮膚皺褶，脫屑，消瘦f.（3月齡）KM正常小鼠。

（三）、KM突變小鼠與KM野生小鼠體重測量比較

KM突變小鼠的體重在相同年齡下均低于KM野生小鼠(P<0.01，或P<0.05)，雄性間差別更顯著。從小鼠生長曲線（圖2）可見KM突變小鼠的體重隨年齡的增長體重增長較慢，雌雄鼠均低于同齡野生KM小鼠。圖中我們可看到KM突變雌雄小鼠在3W-12W內體重幾乎相同，沒有性別差異，12W后，雄性小鼠的體重高于雌性小鼠體重，雄性突變小鼠體重開始增加，而雌性小鼠體重無明顯變化直至6月齡以后才有所增長，到7月齡之后雄性小鼠體重開始下降，雌性小鼠體重也趨于穩定。KM野生小鼠體重增長迅速，且一直在隨年齡增加而增長。

圖2 KM突變和KM野生小鼠體重比較

（四）KM突變小鼠日攝食、飲水測量

3、6月齡突變雌鼠、雄鼠日食量與野生鼠相比無明顯差異，3月突變雌鼠日飲水量高于同齡KM雌鼠（P＜0.05），6月齡突變雄鼠日飲食量，日飲水量均較野生鼠高，其中日飲水量升高有統計學意義（P<0.05）（表4，表5）

表4 3月齡突變和野生小鼠雌雄日攝食、飲水量的比較（x±S ）

同野生小鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；

表5 6月齡突變和野生小鼠雌雄日攝食、飲水量的比較（x±S ）

同野生小鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01。

（五）、KM突變小鼠血常規、生化測量

KM突變小鼠血常規檢測結果為：WBC計數3月齡突變雌雄鼠均高于同齡野生（P<0.05），6月齡突變鼠高于野生鼠，其中6月突變雄鼠高于同齡野生鼠有意義（P<0.01），3月齡突變鼠低于6月齡突變鼠，其中雄性有意義（P<0.05）；RBC計數3月齡突變雌鼠高于6月突變雌鼠，且3月突變雄鼠高于同齡KM鼠（P<0.01）；HGB含量3、6月齡突變雌雄鼠均低于同齡野生鼠（P<0.01），3月突變鼠高于6月突變鼠含量；MCHC為3、6月齡突變雌雄軍低于同齡野生小鼠（P<0.05）；LYM計數3、6月齡突變雌雄鼠均高于同齡野生小鼠（P<0.01）,且3月突變雄鼠低于6月突變雄鼠（P<0.01）；LYM%3月齡突變雌雄鼠高于野生鼠（P<0.05），6月齡突變鼠高于野生鼠無明顯意義，但3月齡突變雄鼠低于6月齡突變雄鼠（P<0.01）；MON計數3、6月齡突變雌雄鼠均高于同齡野生鼠（P<0.01）,3月齡突變雄鼠低于6月齡突變雄鼠（P<0.01）；MON%發生同樣的變化；NEU3月突變雌鼠低于3月突變雄鼠（P<0.01）,3月突變雄鼠高于同齡KM鼠（P<0.01）；NEU%3、6月齡突變雌雄鼠均低于同齡野生小鼠（P<0.01）,3月齡突變雌雄高于6月齡突變雌雄鼠（P<0.01）；BSA3月突變雌鼠高于3月突變雄鼠，3月突變雄鼠低于6月突變雄鼠（P<0.05）；BAS%變化相同；ALY%3月突變雌鼠高于同齡野生鼠（P<0.01）,3月突變雄鼠低于6月突變雄鼠（P<0.01）。（見表6）

KM突變小鼠血生化檢測結果為：GLU3月齡突變雌雄鼠低于3月野生小鼠（P<0.01）,6月齡突變雄鼠低于6月野生雄鼠（P<0.05），且3月突變雌鼠低于3月突變雄鼠（P<0.01）；CHO3月齡突變此雄鼠低于3月野生鼠（P<0.01），3月突變雌雄低于6月突變雌雄鼠（P<0.01）；TG含量3月突變雄鼠低于3月野生鼠，6月突變雌雄鼠低于6月野生雌雄鼠（P<0.05），3月突變雌雄鼠高于6月突變雌雄鼠（P<0.01）,3月突變雌鼠低于3月突變雄鼠（P<0.05）；HDL-C3月突變雌雄鼠低于3月野生鼠，且低于6月突變雌雄鼠（P<0.01）；LDL-C3月突變雌雄鼠高于3月野生鼠，且高于6月突變雌雄鼠（P<0.01）；IgG含量3月突變雌鼠低于6月突變雌鼠，6月突變雄鼠高于6月野生雄鼠（P<0.05）。（見表7）

表6 突變小鼠與KM小鼠主要的血常規指標比較（x±S）

同齡雌雄突變鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；不同齡突變鼠之間相比※P＜0.05 ，※※P＜0.01；

同齡突變鼠與KM鼠相比# P＜0.05，## P＜0.01

表7 突變小鼠及KM小鼠部分血生化指標比較（x±S ）

同齡雌雄突變鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；不同齡突變鼠之間相比※P＜0.05 ，※※P＜0.01； 同齡突變鼠與KM鼠相比#P＜0.05，## P＜0.01.

（六）模型病理特點：

組織切片HE染色結果顯示KM突變小鼠表皮增厚（表8）（圖3），上皮細胞角化過度伴角化不全，顆粒層增厚，基底細胞層水腫；真皮淺層血管擴張充血，炎細胞浸潤，毛囊數目減少（表8），部分毛囊細胞和皮脂腺細胞變性壞死，毛囊內炎細胞浸潤；皮下組織內炎細胞浸潤，脂肪組織內可見多核細胞。3月齡突變小鼠皮膚組織炎癥病變較重，皮下組織可見小膿腫，真皮和皮下組織彌漫性炎細胞浸潤，可見大量多核細胞；6月齡小鼠皮膚炎癥病變較3月齡有所減輕，有少量炎細胞浸潤，膠原致密，皮下脂肪散在多核細胞。（圖4）

甲苯胺藍特染示肥大細胞：真皮層胞質中含紫紅色顆粒、胞核藍色的細胞為肥大細胞。3月齡、6月齡均較正常鼠多見，3月齡突變鼠陽性率高于6月齡（圖5）

圖3小鼠皮膚表皮厚度比較（HE）X100 A野生小鼠 B 突變小鼠

表8 實驗小鼠皮膚表皮厚度和毛囊數目測量比較(計數/mm2) （x±S ）

與野生小鼠比較，﹡P<0.01；與6月齡野生小鼠比較，?P<0.01

圖4突變小鼠皮膚病理改變（HE）X100： A毛囊上皮細胞角化不全伴炎細胞浸潤； B真皮血管擴張伴炎細胞浸潤；C真皮水腫少量炎細胞浸；D真皮顆粒層增厚；E棕色脂肪周圍的白色脂肪內多核細胞和多發性小膿腫；F皮下結締組織的炎細胞浸潤；G,H為對照

圖5甲苯胺藍染色示肥大細胞x200：A.3月齡突變小鼠B.3月齡野生小鼠C.6月齡突變小鼠D.6月齡野生小鼠

（七）皮膚組織炎癥細胞及細胞因子改變

免疫組織化學染色對炎癥細胞及細胞因子進行比較，圖像分析軟件計數鏡下單位視野（1mm2）內陽性細胞數[2]，結果進行半定量分析，結果顯示（表9）：KM突變小鼠3月齡皮膚炎癥細胞CD3、CD4T細胞陽性數比3月齡KM野生小鼠多（P<0.05），主要在表皮和真皮組織；巨噬細胞表面抗原CD68、F4/80比3月齡KM野生小鼠皮膚陽性數多(P<0.05)，其主要在真皮及皮下組織；B細胞表面標記分子CD45R/B220兩者存在一定差異，但差異沒有統計學意義；炎癥因子IL-6、IL-22、TNF-α、INF-γKM突變小鼠陽性細胞數也高于KM野生小鼠（P<0.05），這些炎癥因子也主要存在于真皮及皮下組織內。6月齡KM突變小鼠炎癥細胞CD3、CD4T細胞陽性數比6月齡KM野生小鼠多，主要在表皮及真皮（P<0.01）；巨噬細胞表面抗原CD68陽性細胞數比6月齡KM野生小鼠的多(P<0.01)，皮膚炎癥因子IL-6、TNF-α等也表現為6月齡KM突變小鼠比同月齡KM野生小鼠陽性細胞數多（P<0.01）（圖6）。KM突變小鼠3月齡和6月齡相比較：炎癥細胞CD3、CD4T細胞3月齡陽性數明顯比6月齡的多（P<0.01）；CD68陽性率也表現為3月齡高于6月齡，但目前未發現統計學差異；炎癥因子IL-6、TNF-α3月齡的陽性細胞數明顯比6月齡小鼠多，但IL-6未發現統計學差異。

表 9 小鼠皮膚炎癥細胞及細胞因子的檢測半定量比較（x±S ）

（八）皮膚組織細胞凋亡和增殖改變

（1）細胞凋亡改變

KM突變和KM野生小鼠9天、22天、3月齡和6月齡齡比較，各取5只，每只取5個部位，每個部位隨機選擇1mm2視野，記錄平均陽性細胞數。結果顯示四個年齡段的KM突變小鼠皮膚真皮層及毛囊周圍均有不同程度細胞凋亡，其中22天時凋亡細胞數最多，真皮層及毛囊大量細胞凋亡，突變小鼠多于同齡野生小鼠，其中3月、6月突變小鼠皮膚凋亡細胞增多具有統計學意義（P<0.01）；突變9天與突變22天、6月小鼠間凋亡陽性細胞數差別分別有統計學意義（P<0.05），突變9天與突變3月，KM野生小鼠9天差別無統計學意義； 突變小鼠22天時凋亡細胞數多于突變小鼠9天和3月齡，且有統計學意義（P<0.01和P<0.05），與突變小鼠6月凋亡細胞數相比無顯著性差異；突變小鼠3月、6月之間凋亡陽性細胞數差別沒有統計學意義。（圖7,8）

圖7 小鼠皮膚凋亡染色x 200 A .突變9天 B.突變22天C.突變3月D.突變6月E.野生9天F.野生22天G.野生3月H.野生6月

圖8 小鼠皮膚凋亡染色統計圖

（2）細胞增殖改變

KM突變和KM野生小鼠9天、22天、3月和6月齡比較，各取5只，每只

取5個部位，每個部位隨機選擇1mm2視野，記錄平均陽性細胞數。9天時，KM野生小鼠與KM突變小鼠表皮基底細胞差異無意義，但毛囊及皮脂腺陽性細胞數KM野生小鼠多于突變小鼠差別有統計學意義（p<0.01）；22天時，KM野生小鼠與KM突變小鼠相比：KM野生小鼠表皮基底細胞陽性數多、毛囊及皮脂腺陽性細胞數少，差別分別有統計學意義（p<0.01）；3月齡 表皮及毛囊染色KM野生小鼠陽性細胞數多于KM突變小鼠（P<0.01）；突變小鼠表皮基底部細胞陽性細胞數很少，毛囊及皮脂腺細胞不完全染色，而KM野生小鼠表皮基底部陽性細胞排列均勻，連續，毛囊及皮脂腺細胞完全 ；6月齡KM突變小鼠表皮毛囊陽性細胞數多于KM野生小鼠，表皮P<0.01,毛囊P>0.05；KM突變小鼠表皮基底部細胞增厚，陽性細胞增多，KM野生小鼠無太多變化，但野生小鼠毛囊陽性細胞有所減少。（圖9,10）

圖9小鼠皮膚增殖細胞核抗原（PCNA）染色 X200

A.野生9天B.野生22天C.野生3月D.野生6月E.突變9天F.突變22天G.突變3月H.突變6月

圖10 KM野生和突變小鼠皮膚增殖細胞統計

1．實驗動物

昆明（KM）突變小鼠是我所KM封閉群小鼠繁殖過程中出現的自發突變小鼠，表型異常，全身被毛稀少，表皮增厚有皺褶。為進一步育種研究，于SPF級動物房內進行近交化培育保種，其突變表型可穩定遺傳。

2．模型培育方法

KM突變小鼠種鼠F0與KM小鼠雜交繁殖得到F1代雜合小鼠；再用F1代雜合小鼠自交得到F2代；然后用F1雜合雌鼠與F2代突變雄鼠交配得到F3代；同樣用同窩F3代突變雄鼠與雜合雌鼠交配得到F4代小鼠等，自F3代開始同窩互交，連續繁殖至20代，培育KM突變小鼠的近交系，使群體基因達到高度純合和穩定遺傳。

慢性炎癥性皮膚病常見的有銀屑病、濕疹、神經性皮炎、斑禿、系統性紅斑狼瘡（SLE)等。發病原因很多，如：感染、環境、內分泌、代謝、免疫功能異常及遺傳等。發病范圍廣，發病率高，僅銀屑病的發病率就占世界人口的0.1%～3%，且反復發作，難以治愈，給患者帶來極大的痛苦，嚴重影響生活質量，是醫學上仍未解決的難題之一，越來越受到人們的關注。

目前對慢性炎癥性皮膚病的研究多集中在基因工程小鼠模型，主要通過皮膚上皮細胞角蛋白啟動子構建的轉基因和基因敲除小鼠模型，這種模型通常僅基于單基因操作，而此類疾病被認為是多基因位點共同作用的結果，因此用這種小鼠模型來研究人類復雜炎癥性皮膚病是有缺陷的。也有一些自發突變模型小鼠，如：斑禿模型小鼠C3H /HeJ，狼瘡模型小鼠MRL/lpr、NZB/W.F1等，銀屑病樣表型的自發突變小鼠鱗狀皮膚小鼠（Ttc7fsn / Ttc 7fsn)、慢性增生性皮炎突變小鼠（Sharpincpdm/ Sharpincpdm)、純合皮質突變小鼠（Scd1ab /Scd1ab)等，其表型及病理改變各不相同，均只能反映人類炎癥性皮膚病復雜的病理生理改變的一部分，且在應用過程中有一定的局限性。如斑禿模型小鼠外顯率低，發病不穩定；狼瘡模型小鼠來源困難，價格昂貴；銀屑病模型小鼠在皮損浸潤的炎細胞中缺乏T細胞，并且抗銀屑病的藥物治療無效，因此它們也不是理想的動物模型。

發病機制復雜，研究表明此類疾病多為免疫細胞介導的自身免疫相關性疾病，包括細胞因子網絡復雜的功能及生長因子、趨化因子、炎癥細胞之間的作用等。