H1N1氣管插管感染豬模型

到目前為止，已經報道有2種非人靈長類動物（恒河猴、食蟹猴）和4種嚙齒類動物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家貓以及雞、鴨等禽類可以作為H5N1禽流感病毒動物模型用于實驗研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通過適應建立鼠肺適應株感染小鼠建立小鼠模型。非人靈長類動物通過鼻腔吸入較難感染，通常需要借助輔助器材進行定位感染，動物感染后體征變化不顯著，肺組織出現局灶性病變。

前期研究顯示雪貂的受體分布情況與人極為接近，呼吸氣道長，上下呼吸道分腔明顯是流感病毒研究最為理想的動物模型，缺點是雪貂受物種特異性限制缺乏相應的檢測試劑。小鼠對多種流感病毒敏感，一直被選擇作為流感病毒研究的動物模型，不僅有完備的檢測試劑，還有相應的基因敲除、轉基因小鼠可用于機制方面的研究。早期研究曾在多種非人靈長類動物中（非洲綠猴、Pata猴、豬尾猴、食蟹猴）檢測到血清抗體陽性，并推測猴群感染病毒參與了流感大流行。研究發現非人靈長類動物感染禽流感病毒后的臨床改變、病理變化、抗原分布都與人類存在一定差異，研究結果顯示其對流感病毒敏感性較雪貂、小鼠低。至今沒有直接證據表明非人靈長類動物的受體分布情況與人接近。恒河猴中研究局部肺組織損傷機制不僅與巨噬細胞有關，在研究抗補體機制中還應考慮PAMP的參與，NF-κB 等炎癥信號途徑的作用，這些研究在非人靈長類中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗補體機制研究。

受體比較

1) 人呼吸道上皮受體分布情況：α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體主要分布在鼻粘膜上皮細胞, α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體分布在鼻旁竇、咽、氣管、細支氣管上皮上。在終端呼吸性細支氣管上皮細胞也表達α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體。α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體出現在呼吸細支氣管與肺泡交界的無纖毛立方細支氣管細胞上，部分肺泡壁細胞表達這種受體，這種細胞為肺泡Ⅱ型細胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型細胞內。

2) 雪貂除了氣管中極少數杯狀細胞既表達α-2，3SA受體又α-2，6SA受體，其上下呼吸道受體分布與人極為相似，小鼠多表達α-2，3SA受體，α-2，6SA受體較少，曾局限的認為小鼠較適合用于α-2，3SA受體結合的病毒研究，后有研究發現受體特異性并不影響某些病毒對小鼠的致病力和復制能力。

3)有研究顯示通過體外實驗證實非洲綠猴上皮細胞與人類流感病毒和禽類流感病毒都有較好的結合能力，與人類上皮細胞的結合能力接近。缺乏實驗證據顯示其受體與人類受體分布相似度。

6.2感染途徑比較

1) 小鼠、雪貂通過輕微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式與人極為接近。

2) 恒河猴、綠猴、食蟹猴等需要以環甲膜穿刺、支氣管鏡定位感染等方式進行感染，感染途徑與自然感染途徑差別較大，感染效果通常會出現肺組織局域性灶狀感染，與吸入性感染方式產生的病變程度、范圍存在一定差別。

感染后癥狀

1) 部分禽流感病毒在猴上皮細胞中復制受限或者發生不同程度的衰減。例如禽來源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染劑量103倍的劑量感染猴，仍不致死，僅產生一過性體溫升高。

2) 幾乎所有禽流感病毒都能夠在雪貂中成功復制，并產生臨床可觀察的改變，例如體溫升高、體重下降、噴嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出現嚴重的肺炎，除呼吸道以外還在腦、脾、肝等組織中發現病毒抗原，并在腦組織中出病理改變，猴感染后在呼吸道以外的組織中未發現病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉基因小鼠在賽業（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標準的動物模型制備相關完備監督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規定進行，實驗動物尸體實行無害化處理，對生態環境無影響。

1. 豬模型感染后臨床癥狀變化

感染病毒后，實驗豬感染后未見明顯臨床癥狀，無死亡，存活率如圖1所示。

圖1 感染后豬存活率（n=3）

2.豬模型感染后病毒在肺組織中復制情況

實驗豬在感染后第5d處死取肺組織，通過RT-PCR，可以檢測到肺組織有病毒RNA復制，如圖2所示。

圖2 感染后豬肺組織載量（n=2）

3. 豬模型感染后組織病理損傷

實驗豬在感染后第5d處死取肺組織，免疫組織化學（IHC）檢測發現病毒抗原分布在豬肺組織上。HE染色結果證實感染后豬肺組織即呈現出典型的流感病毒感染的病理表現，包括炎性充血和滲出性病理改變等等，并逐漸發展為間質性肺炎，如圖2所示。

圖2感染后豬肺組織切片HE染色和免疫組化分析。G: 正常豬肺組織切片HE染色對照; G’: 感染后豬局部肺組織織切片HE染色; G’’: 感染后豬局部肺組織免疫組化。

豬既能感染人流感病毒，又能被禽流感感染，是因為豬上皮細胞表面同時存在著人和禽流感病毒的受體，而所有亞型流感病毒HA都識別唾液乳糖絲氨酸酶。禽流感傾向于結合SAα2,3半乳糖相聯的結構，而人流感病毒傾向于與SAα2,6半乳糖相聯的結構結合。SA分布于所有的流感病毒宿主體內，豬的氣管中同時存在著SAα2,3半乳糖和SAα2,6半乳糖受體。豬通常被認為是流感病毒的混合器，自然界流行的流感病毒經過豬感染或傳代后，出現病毒重組產生新的病毒。

制作流感病毒感染動物模型應用SPF小型豬，4月齡。

病毒株為A/California/07/2009(H1N1)，實驗豬經過麻醉后待肌肉徹底放松，將其放置仰臥位，用喉鏡撐開會厭，通過氣管插管將病毒，感染劑量為107 TCID50病毒液滴入上呼吸道。感染后觀察臨床癥狀，監測存活率及體重變化率。感染后5d處死，收集肺組織，進行肺組織載量檢測和病理學檢查。

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，它通過飛沫傳播，能在短時間內迅速蔓延。2009年起源于北美的甲型H1N1流感曾經造成世界范圍內的大流行，WHO曾將其警戒級別提升至最高級別6級，給人類社會和經濟造成極大的負面影響。一項由WHO組織開展的研究顯示，在2009至2010年的流感季中，全世界共有20%至27%的人被甲型H1N1病毒感染。盡管2010年8月WHO宣布已進入“流感大流行后期”，意味著“正常監測顯示大多數國家的流感活動水平已恢復到季節性流感水平”，但同時指出，“局部地區仍有暴發甲型H1N1流感疫情的可能。”

本次疫情患者感染的是一種H1N1亞型流感病毒新毒株，它包含人流感病毒、北美禽流感病毒和北美、歐洲、亞洲三類H1N1流感病毒的基因片段。這種病毒已被證實經由人際傳播，人感染后會出現高燒、精神不振、厭食、咳嗽等癥狀?？茖W家指出，打噴嚏、咳嗽和物理接觸都有可能導致甲型H1N1流感病毒在人群間傳播。這次甲型H1N1流感病毒呈現的另一大特點是對青壯年攻擊性強，目前確診甲型H1N1流感死者中大多數年齡都在25~ 45歲之間。

疾病臨床表現及致病機制

根據甲型H1N1流感病毒特性，該病的傳播途徑可能是通過近距離空氣飛沫傳播，以及接觸病豬、病人呼吸道分泌物和密切接觸造成傳播。傳播模式為：（1）主要是由于人吸入感染豬、人的分泌物或排泄物；（2）直接接觸病豬、人后，通過人的消化道，呼吸道，皮膚損傷和眼結膜等途徑傳播；（3）現有資料尚不支持垂直傳播的存在；4）而在豬、人中是多途徑傳播的?？赏ㄟ^空氣飛沫,水源,密切接觸,垂直傳播,人的機械傳播和蚊蟲叮咬傳播等。

大多數人感染甲型H1N1病毒后僅表現為輕癥，而少數患者感染后，會表現出迅速加重的下呼吸道感染，發生急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS），甚至呼吸衰竭、多器官功能障礙綜合癥（MODS）等，危及患者生命。