H3N2滴鼻感染BALB/c小鼠模型

到目前為止，已經報道有2種非人靈長類動物（恒河猴、食蟹猴）和4種嚙齒類動物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家貓以及雞、鴨等禽類可以作為H5N1禽流感病毒動物模型用于實驗研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通過適應建立鼠肺適應株感染小鼠建立小鼠模型。非人靈長類動物通過鼻腔吸入較難感染，通常需要借助輔助器材進行定位感染，動物感染后體征變化不顯著，肺組織出現局灶性病變。

前期研究顯示雪貂的受體分布情況與人極為接近，呼吸氣道長，上下呼吸道分腔明顯是流感病毒研究最為理想的動物模型，缺點是雪貂受物種特異性限制缺乏相應的檢測試劑。小鼠對多種流感病毒敏感，一直被選擇作為流感病毒研究的動物模型，不僅有完備的檢測試劑，還有相應的基因敲除、轉基因小鼠可用于機制方面的研究。早期研究曾在多種非人靈長類動物中（非洲綠猴、Pata猴、豬尾猴、食蟹猴）檢測到血清抗體陽性，并推測猴群感染病毒參與了流感大流行。研究發現非人靈長類動物感染禽流感病毒后的臨床改變、病理變化、抗原分布都與人類存在一定差異，研究結果顯示其對流感病毒敏感性較雪貂、小鼠低。至今沒有直接證據表明非人靈長類動物的受體分布情況與人接近。恒河猴中研究局部肺組織損傷機制不僅與巨噬細胞有關，在研究抗補體機制中還應考慮PAMP的參與，NF-κB 等炎癥信號途徑的作用，這些研究在非人靈長類中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗補體機制研究。

受體比較

1) 人呼吸道上皮受體分布情況：α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體主要分布在鼻粘膜上皮細胞, α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體分布在鼻旁竇、咽、氣管、細支氣管上皮上。在終端呼吸性細支氣管上皮細胞也表達α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體。α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體出現在呼吸細支氣管與肺泡交界的無纖毛立方細支氣管細胞上，部分肺泡壁細胞表達這種受體，這種細胞為肺泡Ⅱ型細胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型細胞內。

2) 雪貂除了氣管中極少數杯狀細胞既表達α-2，3SA受體又α-2，6SA受體，其上下呼吸道受體分布與人極為相似，小鼠多表達α-2，3SA受體，α-2，6SA受體較少，曾局限的認為小鼠較適合用于α-2，3SA受體結合的病毒研究，后有研究發現受體特異性并不影響某些病毒對小鼠的致病力和復制能力。

3)有研究顯示通過體外實驗證實非洲綠猴上皮細胞與人類流感病毒和禽類流感病毒都有較好的結合能力，與人類上皮細胞的結合能力接近。缺乏實驗證據顯示其受體與人類受體分布相似度。

6.2感染途徑比較

1) 小鼠、雪貂通過輕微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式與人極為接近。

2) 恒河猴、綠猴、食蟹猴等需要以環甲膜穿刺、支氣管鏡定位感染等方式進行感染，感染途徑與自然感染途徑差別較大，感染效果通常會出現肺組織局域性灶狀感染，與吸入性感染方式產生的病變程度、范圍存在一定差別。

感染后癥狀

1) 部分禽流感病毒在猴上皮細胞中復制受限或者發生不同程度的衰減。例如禽來源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染劑量103倍的劑量感染猴，仍不致死，僅產生一過性體溫升高。

2) 幾乎所有禽流感病毒都能夠在雪貂中成功復制，并產生臨床可觀察的改變，例如體溫升高、體重下降、噴嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出現嚴重的肺炎，除呼吸道以外還在腦、脾、肝等組織中發現病毒抗原，并在腦組織中出病理改變，猴感染后在呼吸道以外的組織中未發現病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉基因小鼠在賽業（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標準的動物模型制備相關完備監督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規定進行，實驗動物尸體實行無害化處理，對生態環境無影響。

1. 小鼠模型感染病毒后臨床癥狀變化

小鼠感染病毒后，感染后的臨床表現為：感染后的第3天，小鼠開始出現了弓背、豎毛、蜷縮、行動遲緩等一系列的癥狀表現。

感染后小鼠出現明顯的體重下降，在感染后的第9天內，小鼠全部死亡，體重下降率接近30%，小鼠存活率和體重變化率。

2.小鼠模型感染病毒后在各組織中的分布及復制動力曲線

在小鼠感染H3N2病毒后第1-9d，安樂死小鼠，檢測小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管內的病毒復制情況，結果顯示，在感染后不同的天數，肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管這些組織臟器當中能檢測得到病毒載量。在感染后第2-5d肺和氣管組織中病毒復制達到高峰，尤其是肺當中最高的滴度達到了105.5TCID50/ml。

3.小鼠模型感染病毒后組織病理改變

小鼠感染病毒后，分不同天數安樂死小鼠，取組織檢測病理改變，結果顯示，氣管、心、肝、腎組織均未發現明顯的病理變化。在感染后第1-5 d內，隨著感染天數增加，肺組織病變區域逐漸增大，病變愈發嚴重。在感染后第1d，局部肺泡間隔輕度增寬，少數支氣管上皮細胞變性壞死；在感染后第3d，肺泡間隔明顯增寬，支氣管上皮細胞變性壞死，肺泡內可見少量炎細胞滲出，血管周圍水腫，少量出血；在感染后第5d，肺組織呈現間質性肺炎這一病毒感染引起的典型病理改變，肺泡間隔增寬程度增加，部分區域肺泡腔消失，炎細胞浸潤，肺泡內可見較多的炎細胞及漿液纖維素滲出，支氣管上皮細胞變性壞死，血管擴張充血；在感染后第7d，肺組織病變略有減輕，結果如圖4所示。

免疫組織化學結果與HE染色結果大體一致。結果顯示，在感染后第1-5 d內，抗原顆粒隨著感染天數呈現增加的趨勢。在感染后第1d，支氣管上皮細胞呈現輕度陽性；在感染后第3d，支氣管上皮細胞陽性增強，肺細胞內巨噬細胞呈現輕度陽性；在感染后第5d，支氣管上皮細胞、肺細胞內巨噬細胞呈現出強陽性；在感染后第7d，支氣管上皮細胞、肺細胞內巨噬細胞陽性程度降低。

4.小鼠模型感染病毒后細胞因子變化

小鼠感染病毒后，分別在感染后第3d和5d采血分離血清并收集肺泡灌洗液，利用微量樣本多重蛋白定量技術（Cytometric Bead Array,CBA）對樣本中炎性細胞因子的表達水平進行檢測。結果發現，小鼠的血清內IL-1β、MCP-1、IL-1α、GM-CSF的表達升高。在病毒感染后第5天血清內IFN-γ的表達明顯增加，結果。

小鼠肺泡灌洗液中細胞因子IL-1α、IL-6、IL-5、TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達明顯升高，同時趨化因子MCP-1、GM-CSF的表達增加，尤其是MCP-1分泌水平急劇升高，并在感染后3天達到分泌高峰。

小鼠由于繁殖周期短、遺傳背景均一、個體差異小等優點，被廣泛用作流感病毒研究的動物模型，流感病毒在小鼠體內能否易感與相應受體有關。實驗室所用的近交系和雜交系小鼠的呼吸道雖然都有所表達α-2,3和α-2,6兩種唾液酸受體，但其中α-2,3交聯唾液酸受體的數量占有優勢。根據細胞表面受體分布的特點，小鼠通常只對禽流感病毒易感。而一些研究表明，小鼠能夠突破受體限制性，對絕大多數的人流感、豬流感都能感染成功，但具有α-2,6交聯唾液酸受體結合偏嗜性的野生型季節性流感病毒H3N2并不能直接成功感染小鼠。季節性流感病毒H3N2野生株雖不能直接感染小鼠，但國際上已建立有H3N2流感病毒小鼠感染模型，其大部分采用的是建立鼠適應株、反向遺傳學技術構建整合毒株的方式，即從對病毒進行不斷改造的角度進行構建。

病毒株為季節性流感病毒A/Aichi/2/68/H3N2經過小鼠體內7次傳代后所獲得鼠肺適應株，BALB/c小鼠經過輕度麻醉后滴鼻感染病毒，小鼠感染后觀察14天，監測存活率及體重變化率。感染后分時間段安樂小鼠，分別在0、3、5d采血分離血清并收集肺泡灌洗液進行細胞因子檢測；不同時間點取小鼠肺、脾、腦、心等組織，進行病毒滴度測定和組織病理學檢查。

流感病毒是嚴重威脅人類健康的一種病原體，它能導致流感疫情甚至世界大流行，流感在各個年齡階段的人群中都可能爆發而引起急性發熱性呼吸道疾病。流感病毒為單股負鏈RNA病毒，屬于正黏液病毒科，呈球形或絲狀，直徑80-120nm。病毒外層為兩種不同糖蛋白構成的輻射狀突起，即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)。根據HA和NA抗原的不同,又可分為許多亞型，H可分為16個亞型，N有9個亞型(N1～N9)。H3N2亞型流感病毒1968年最早出現于香港，后傳播到日本、美國等地，引發了一場流感世界大流行，致死人數達到近100萬人。此后，雖未再次引起世界大流行，但散發流行至今。近年來，世界范圍的流感流行病學監控和調查分析顯示，該亞型流感病毒在仍是流行優勢株，僅1968-1992年間我國發生的10次流感小流行中就有7次都是由H3N2流感病毒所引起，并且在1998年和2002年我國也都發生了較大范圍的H3N2流感流行，其中北京市1998年11-12月的人群總發病率高達10%，總發病人數達到了100萬以上。

疾病臨床表現及致病機制

人感染H3N2流感病毒后，癥狀與普通人流感相似，臨床表現包括發熱（病毒感染發熱一般是持續的，但下午較其他時間溫度要高）、咳嗽、喉嚨痛、身體疼痛、頭痛、發冷和疲勞等，有些還會出現腹瀉和嘔吐，重者會繼發肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。H3N2流感病毒傳播速度快，人體對新變異病毒沒有天然抗體。一般通過打噴嚏、咳嗽和物理接觸方式傳播。感染病毒的患者以青壯年為主，大多數年齡在25歲至45歲之間。由于個人免疫情況不一樣，年輕人、兒童感染后，更容易出現流感樣的癥狀，體溫超過38℃，全身肌肉酸痛。老年人的反應就不會那么強烈，好多老年人感染后體溫就不會很高，機體反應沒有兒童敏感。

目前為廣大學者接受的H3N2流感病毒致病機制主要有如下幾種：①病毒誘導宿主細胞產生凋亡是其致細胞病變的重要機理之一；②病毒感染后對細胞造成的氧化應激損傷也是學者普遍接受的致病機制；③細胞因子風暴學說等其他學術學說和理論。以上3種機制相互聯系，并且均與凋亡密切相關。

流感病毒感染機體后，可損害呼吸道上皮、肺上皮細胞，也可損傷肺外器官。不管在體內或體外流感病毒都可誘導宿主細胞凋亡，流感病毒誘導細胞凋亡可能是通過多條途徑實現的，各條途徑又互相聯系，參與成分既有病毒的，也有細胞成分。整個過程由于多種細胞因子及病毒蛋白的參與而變得錯綜復雜。病毒感染引起宿主細胞凋亡損害宿主，但另一方面，宿主也通過這一方式限制病毒在機體內的增殖和擴散。病毒感染細胞后，若細胞迅速發生凋亡，則不利于病毒的繁殖。