EV71感染SCARB2轉基因小鼠模型

采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發生后肢癱瘓最終導致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現癱瘓后遺癥。

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發現以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經系統感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復制并傳播到腦組織的重要部位。

2.重癥小鼠模型組織病理學變化

運用組織病理學和免疫組織化學技術，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學觀察（圖4），發現3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發生細胞源性水腫，神經元發生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經元變性壞死，出現紅色神經元，并可見衛星現象和嗜神經現象，腦干組織中的神經元發生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發生大面積間質性肺炎，間質增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發生大面積空泡變性。免疫組織化學檢測發現在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態變化。結果發現，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發生某時間點的爆發性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發現重癥小鼠血清爆發性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調4倍；48 hpi重癥IL-13上調1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調4倍和87倍。以上數據說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發揮重要作用。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發現小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低，符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態。并且發現二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L，PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發現了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態。以上血氣結果結合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態。

5. EV71小鼠模型超微病理學變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質內含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中，肌細胞內可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內外膜和嵴突結構清晰可見。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發生退行性變，細胞內出現水腫，部分肌原纖維發生溶解，肌質中的胞漿內容物減少，糖原顆粒甚至消失；線粒體腫脹、空化，基質電子密度降低，內室腫脹，嵴和膜結構模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化；骨骼肌細胞核固縮，染色質邊集，異染色質明顯增多，發生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經元胞漿中的細胞器豐富，內質網發達，平行或不規則排列，其間游離存在核糖體；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內外膜和嵴突結構清晰；腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻。感染組腦組織超微病變輕微，神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富；神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹；有髓神經纖維髓鞘發生層面分離，導致小泡性分離，呈現泡狀改變。

對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富；脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達。感染組脊髓前角神經元中粗面內質網擴張，出現尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質增多，細胞器減少，粗面內質網和高爾基復合體呈現不同程度的擴張，細胞質呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導致粗面內質網脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數量減少。小膠質細胞包圍吞噬神經元細胞，呈現嗜神經現象。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內可見呈淺亮的常染色質和呈深色顆粒狀的異染色質，胞質少而薄，胞漿內可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器豐富；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，核周細胞質電子密度降低，粗面內質網、核糖體、高爾基復合體等細胞器減少，胞質出現細小空泡變，嗜鋨性板層小體或出現排空現象，溶酶體增多；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發生了間質性肺炎。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風險的病原，人類感染風險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

pCMV6-XL5-h-SCARB2質粒購自美國Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)質粒中巨細胞瘤病毒（CMV）啟動子下游，構建全身表達人SCARB2的載體。轉基因載體經測序驗證后，用Pvu I將載體線性化，Sephedex G50柱純化。將DNA濃度調整至5 ng/uL，用顯微注射法將DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉基因小鼠。經鼠尾DNA PCR對首建鼠的基因型進行鑒定，得到陽性首建鼠3只（圖1A）。隨后，用逆轉錄PCR分析了首建鼠F1代組織中目的基因的表達情況，發現人SCARB2主要在轉基因小鼠的骨骼肌和腦組織中表達（圖1B）。隨后，分別用Western Blot和免疫組化分析了人SCARB2蛋白在腦和骨骼肌組織中的表達情況。由于人SCARB2與小鼠SCARB2同源性較高，存在抗體交叉結合現象。Western Blot發現轉基因小鼠腦和骨骼肌組織中SCARB2蛋白表達量高于同窩陰性（圖1C-1D）。免疫組化發現SCARB2蛋白主要分布于轉基因小鼠的骨骼肌和腦組織中（圖2A-2B），該結果表明成功建立了腦和肌肉組織表達人SCARB2蛋白的轉基因小鼠。

注：M：DNA分子質量標準；1-15：首建鼠；NTG：同窩陰性小鼠；TG：轉基因小鼠；A：PCR鑒定陽性首建鼠；B：逆轉錄PCR分析轉基因小鼠組織內人SCARB2基因表達；C： Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉基因小鼠腦組織中的表達，GAPDH為內參；D： Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉基因小鼠骨骼肌組織中的表達，GAPDH為內參。

Note: M: DNAmolecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line; NTG: Negative littermates; TG: Transgenicmice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNAas template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 geneexpression in tissues of Tg mice; C: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDHexpression

EV71感染SCARB2轉基因幼鼠表型

為研究表達人SCARB2對EV71感染轉基因小鼠的促進作用。我們分別用MP10毒株感染不同年齡段的小鼠，發現兩周齡以下的轉基因小鼠和野生型小鼠在感染病毒后，會于10天內死亡，肌肉組織內病毒載量超過108拷貝/毫克，轉基因小鼠與野生型小鼠在病毒復制方面差別不大。因此，我們用２ ×１０６ ＴＣＩＤ５０MP10毒株200uL分別感染了21日齡的轉基因小鼠和野生型小鼠，主要研究了表達人SCARB2受體組織內的病毒復制情況。發現在感染后3天（病毒復制的最高峰）轉基因小鼠骨骼肌和腦中EV71的拷貝數顯著高于同窩陰性小鼠（圖3A-3B），隨后，用免疫組化研究了組織內的病毒分布情況。EV71抗原主要分布于轉基因小鼠的腦組織中，而野生型小鼠腦組織中未檢測到病毒抗原（圖4A）。轉基因小鼠骨骼肌組織內均分布著大量的EV71抗原，與和野生型小鼠比兩者間差異明顯（圖4B）。表明表達人SCARB2可促進EV71對轉基因小鼠組織的感染，證實該蛋白在體內可發揮EV71受體的功能。

SCARB2轉基因動物模型，無特定病原體(specific-pathogen free，SPF) ICR小鼠，6周齡，雌性，體重18-20g。

背景品系為ICR封閉群小鼠， Hauschka用Swiss小鼠群以多產為目標，進行選育，以后美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research）分送各國飼養實驗，各國稱為ICR。

人腸道病毒71型（EV71）是微核糖核酸病毒科腸病毒屬腸病毒種A型RNA病毒， 1969年首次在加利福尼亞神經異常的病人體內分離并鑒定。EV71被認為是嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原體之一。該病毒感染偶爾伴隨嚴重的并發癥，包括腦干腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性弛緩性麻痹和心力衰竭。最近幾十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范圍內大爆發，目前主要集中于亞太地區。中國大陸的EV71病毒感染始見于1987年冬季湖北省HFMD的流行，自1999年以來，我國廣東、福建、上海、重慶等地區也報告了局部流行的EV71感染，與1998年臺灣地區報道120,000例爆發手足口病，其中有78例死亡不同，大陸EV71引起的HFMD和神經系統癥狀較輕。以往研究認為人脊髓和腦干是EV71感染的靶標，但其感染機制和致病機制尚不明確。

2009年日本學者首次利用細胞實驗鑒定了EV71的兩種人受體蛋白，分別為P選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)和人清道夫受體B2（SCARB2）。通過建立表達PSGl-1的轉基因小鼠，我們證實人PSGL-1有一定的促進EV71感染轉基因小鼠的功能。為進一步在體內證實人SCARB2的受體功能，以期改良現有的EV71感染小鼠模型，我們通過建立表達人SCARB2基因的轉基因小鼠，在體內驗證了該蛋白的受體功能。