Crtc1基因敲除肥胖小鼠模型

Crtc1，一種調節CREB活性的轉錄輔助因子，已參與代謝綜合征的發病機理。但是，Crtc1對脂肪組織代謝的影響及其潛在機制尚不清楚。我們首先發現Crtc1-/-小鼠的體重和脂肪重量（包括sWAT，eWAT和BAT）顯著增加，血漿進行了生化分析，發現與Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠出現了高血糖癥。

我們發現缺乏Crtc1嚴重損害了小鼠的生殖能力。Crtc1缺失對肝臟的脂代謝無顯著影響。然而，通過H＆E染色證實，Crtc1-/-小鼠的脂肪細胞的面積有顯著增加的趨勢。總之，我們的研究發現，Crtc1-/-缺乏引起脂肪堆積可能與PPARγ信號通路的激活有關；表明CRTC1可能成為治療肥胖的一個潛在分子靶點。

模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。

（2）設計參數

室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風和空調系統

動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。

（4）照明系統

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統

因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。

（6）監控系統

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。

（8）供電系統、警報系統和消防設施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。

（9）消毒滅菌設備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養籠具

飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。

dsDNA升高，皮膚破損，皮膚炎性細胞浸潤。

血清學檢測抗dsDNA和抗ANA抗體，表型觀察皮膚破損情況，病理觀察淋巴細胞浸潤情況。

1.項目策略圖

此模型采用CRISPR/Cas9技術對Crtc1基因進行基因編輯，原理示意圖如下：

2.項目策略概述

利用CRISPR/Cas9技術，設計并體外轉錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現靶位點堿基序列缺失，實現基因敲除。

3.gRNA序列信息

gRNA1:GCTGACATCTGTGAATTGTA (5’ – 3’), PAM: GGG.

gRNA2:CTGCATGCTGGATCGACAGG (5’ – 3’), PAM: TGG.

4. 正常喂養條件下，檢測8個月大的Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的體重，心臟，肝臟，體重，eWAT，sWAT，和BAT的重量。

5. 正常喂養條件下，檢測8個月大時Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的甘油三酸酯，總膽固醇，FABP4含量。通過油紅O或H＆E染色，檢測肝和eWAT的脂肪細胞面積，并進行量化。

圖1. 構建Crtc1敲除鼠。（A）使用CRISPR/Cas9系統敲除Crtc1基因示意圖。（B）通過PCR鑒定Crtc1敲除鼠。（C）Western blotting檢測Crtc1的蛋白質水平。2.2 Crtc1敲除小鼠不育 我們發現Crtc1的全身缺乏會導致生育能力嚴重受損。在Crtc1-/-雄性和Crtc1-/-雌性小鼠的三個交配籠子中，只有一只小鼠出生，并立即死亡。但是，雜合的Crtc1 +/-小鼠具有正常的生育能力，并以預期的孟德爾頻率出生（表1）。表1雜合Crtc1+/-小鼠交配后代小鼠信息

2.3 Crtc1敲除小鼠會造成自發肥胖 在正常喂養條件下，與8個月大的Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠顯示出明顯更大的體型和較重的體重（圖2A）。顯然，體重增加的原因主要包括eWAT，sWAT和BAT脂肪重量增加（圖2E-G）。這些數據表明在發育過程中Crtc1-/-小鼠自發地發展為肥胖。

圖2. Crtc1-/-小鼠自發地發展為肥胖結果。（A）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的代表性圖像和體重；（B）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠進食量的觀察；（C）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠進食量的柱狀圖展示；（D）Crtc1缺失對不同器官重量的影響，包括肝臟, eWAT，sWAT和BAT。數據為平均值±SEM。* P <0.05；** P <0.01，*** P <0.001，n.s. 表示無統計學差異。

CRTC1缺失加速脂肪細胞中脂肪的積累

盡管兩組之間的血漿TC和TG沒有統計學差異，但是Crtc1-/-小鼠血漿FABP4的水平較高，FABP4是主要由脂肪細胞分泌的脂肪因子（圖3A-C）。 此外，與Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠的空腹血糖（FBG）水平顯著升高（圖3D）。 肝臟和脂肪是控制脂質代謝的主要組織。 H＆E和油紅O染色顯示Crtc1缺乏對肝臟形態和脂質滴的形成沒有顯著影響（圖3E）。 但是，我們發現與Crtc1 + / +小鼠相比，來自Crtc1-/- eWAT的脂肪細胞平均面積顯著增加（圖3G）。 這些數據表明，Crtc1缺失后脂肪積累的增加可能歸因于脂肪細胞的分化和成熟。

圖3. Crtc1-/-小鼠脂質代謝異常相關結果。（A-C）8個月大時Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的甘油三酸酯（A），總膽固醇（B），FABP4含量（C）的循環水平。（D）來自Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的肝組織的油紅O或H＆E染色。（E）肝臟油紅色陽性區域的定量。（F）來自Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的eWAT的H＆E染色。（G）eWAT中脂肪細胞面積的量化。數據為平均值±SEM。* P <0.05；*** P <0.001和n.s. 表示無統計學差異。TG，甘油三酸酯。TCh，總膽固醇。

一、疾病概述 肥胖，與多種高危疾病相關，包括胰島素抵抗，血脂異常，高血壓，心血管疾病和癌癥。在肥胖的發展過程中，白色脂肪組織（WAT）中脂肪細胞的體積增大和/或脂肪細胞數量增多，導致WAT感知營養的能力受損，并進一步導致異位脂質沉積。在功能上，皮下白色脂肪組織（sWAT）具有比附睪白色脂肪組織（eWAT）有更大的成脂分化能力。然而，當sWAT無法容納過多的脂肪沉積時，eWAT中的脂肪積累在一定程度上反映了代謝風險。多種因素與脂肪堆積相關，包括年齡，性別，性激素，遺傳學，種族，生活方式等。因此，如何有效的減少脂肪堆積是該領域的主要挑戰之一。二、模型背景1、Crtc1基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：382056? 敲除基因NCBI網址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 382056? 敲除基因名稱（MGI號）：Crtc1（MGI: 2142523）? 敲除基因Ensembl網址鏈接：http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000003575;r=8:70382355-70439579? 方案針對的轉錄本（Ensembl號）：ENSMUST00000076615.5? 方案敲除的exon：exon2-exon42、實驗動物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作"標準"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。 主要用途：是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。3、研究背景 Crtc1, CREB調控轉錄共激活因子1，系CREB轉錄輔因子家族的成員之一，在存在cAMP刺激的情況下，可作為調節CREB活性的傳感器[1, 2]。前期研究發現，Crtc1缺失對小鼠生殖能力有顯著影響，還參與了晝夜節律的調節[3]，外周葡萄糖代謝[4]，心臟功能[5]，記憶形成[6]，抑郁癥[7]等生理、病理進程。肥胖，與多種高危疾病相關，包括胰島素抵抗，血脂異常，高血壓，心血管疾病和癌癥。許多病因包括年齡，性別，性激素，遺傳學，種族，生活方式等，都有助于脂肪積累[8, 9]。如何有效的減少脂肪堆積仍是該領域的主要挑戰。有趣的是，我們發現Crtc1-/-小鼠會發生自發的肥胖，且目前并無相關研究探究Crtc1在脂肪組織中的作用，因此，我們首先探究Crtc1對脂肪組織代謝的影響和潛在分子機制的研究。另有相關研究表明，Crtc1與呼吸系統相關疾病也有關系。有研究[10]發現LKB1通過促進CRTC1從細胞核的胞質易位而負調控NEDD9轉錄，部分逆轉了LKB1對肺癌細胞轉移的抑制作用。該研究結果為解釋LKB1缺乏促進肺癌進展和轉移提供了潛在的分子機制與治療靶點。另有研究發現[11-13]，在肺粘液表皮樣癌（MEC）在很多情況下，伴隨著新型融合癌基因（CRTC1-MAML2）的復發性t（11; 19）易位，CRTC1-MAML2癌基因充當Notch和CREB調節途徑的轉錄因子，破壞正常的細胞周期和分化，從而促進腫瘤的發展。CRTC1-MAML2不僅可以作為判斷腫瘤是否發生的標志物，也顯著影響腫瘤患者的預后狀況和抗腫瘤藥物的治療效果。有研究通過microRNA 組學分析，卵白蛋白（OVA）誘導的過敏性氣道炎癥（AAI）小鼠的肺組織中miRNA的改變，鑒定出miR-17，miR-144和miR-21可能發揮重要作用，通過計算機預測分析出轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白（Creb1）及其轉錄共激活因子（Crtc1-3）可能作為其潛在靶點，有望成為治療哮喘疾病的靶點[14]。參考文獻：1. Altarejos, J.Y., et al., The Creb1 coactivator Crtc1 is required for energy balance and fertility. Nat Med, 2008. 14(10): p. 1112-7.2. Iourgenko, V., et al., Identification of a family of cAMP response element-binding protein coactivators by genome-scale functional analysis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(21): p. 12147-52.3. Jagannath, A., et al., The CRTC1-SIK1 pathway regulates entrainment of the circadian clock. Cell, 2013. 154(5): p. 1100-1111.4. Kim, G.H., et al., Leptin recruits Creb-regulated transcriptional coactivator 1 to improve hyperglycemia in insulin-deficient diabetes. Mol Metab, 2015. 4(3): p. 227-36.5. Morhenn, K., et al., Mechanistic role of the CREB-regulated transcription coactivator 1 in cardiac hypertrophy. J Mol Cell Cardiol, 2019. 127: p. 31-43.6. Uchida, S., et al., CRTC1 Nuclear Translocation Following Learning Modulates Memory Strength via Exchange of Chromatin Remodeling Complexes on the Fgf1 Gene. Cell Rep, 2017. 18(2): p. 352-366.7. Wang, Y.J., et al., Imipramine exerts antidepressant-like effects in chronic stress models of depression by promoting CRTC1 expression in the mPFC. Brain Res Bull, 2020. 164: p. 257-268.8. Emerging Risk Factors, C., et al., Separate and combined associations of body-mass index and abdominal adiposity with cardiovascular disease: collaborative analysis of 58 prospective studies. Lancet, 2011. 377(9771): p. 1085-95.9. Malden, S., et al., Obesity in young children and its relationship with diagnosis of asthma, vitamin D deficiency, iron deficiency, specific allergies and flat-footedness: A systematic review and meta-analysis. Obes Rev, 2020.10. Feng, Y., et al., The CRTC1-NEDD9 signaling axis mediates lung cancer progression caused by LKB1 loss. Cancer Res, 2012. 72(24): p. 6502-11.11. Von Holstein, S.L., et al., CRTC1-MAML2 gene fusion in mucoepidermoid carcinoma of the lacrimal gland. Oncol Rep, 2012. 27(5): p. 1413-6.12. O'Neill, I.D., Gefitinib as targeted therapy for mucoepidermoid carcinoma of the lung: possible significance of CRTC1-MAML2 oncogene. Lung Cancer, 2009. 64(1): p. 129-30.13. O'Neill, I.D., t(11;19) translocation and CRTC1-MAML2 fusion oncogene in mucoepidermoid carcinoma. Oral Oncol, 2009. 45(1): p. 2-9.14. Bartel, S., et al., Pulmonary microRNA profiles identify involvement of Creb1 and Sec14l3 in bronchial epithelial changes in allergic asthma. Sci Rep, 2017. 7: p. 46026.