AAV注射誘導(dǎo)恒河猴多系統(tǒng)萎縮模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進(jìn)入實驗室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1、注射過表達(dá)α-synuclein腺相關(guān)病毒的恒河猴行為學(xué)表現(xiàn)

Viewpoint視頻監(jiān)測系統(tǒng)檢測動物運動量

在腦立體定位注射過表達(dá)α-synuclein的腺相關(guān)病毒手術(shù)后，通過Viewpoint視頻系統(tǒng)對動物進(jìn)行運動量檢測，注射AAV-MBP-SYN的模型動物結(jié)果。

注射Olig001-CBH-SYN的模型動物結(jié)果。

構(gòu)建過表達(dá)α-synuclein的腺相關(guān)病毒AAV-MBP-SYN及Olig001-CBH-SYN，分別以AAV-MBP-GFP及Olig001-CBH-GFP作為其對照，通過腦立體定位注射的方法注射到恒河猴（4-5周歲，體重3.5-5.5公斤）紋狀體內(nèi)，從而建立多系統(tǒng)萎縮的恒河猴模型。每只動物注射100μl，滴度為5×1012gcp/ml。

一、疾病名稱

多系統(tǒng)萎縮（Multiple system atrophy，MSA）

二、MSA簡介

臨床癥狀主要特征為植物神經(jīng)功能紊亂，震顫，運動緩慢，肌肉僵硬，體位不穩(wěn)和共濟(jì)失調(diào)等。

病理表現(xiàn)主要為大腦多個部位（包括基底神經(jīng)節(jié)，橄欖下核和小腦）的神經(jīng)細(xì)胞變性、脫失和膠質(zhì)細(xì)胞增生，在少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的細(xì)胞核、胞漿中存在嗜銀包涵體。病變最嚴(yán)重的部位主要位于錐體外系（殼核、尾狀核、蒼白球、黑質(zhì)、丘腦底核）、腦干（藍(lán)斑、下橄欖核、腦橋核、迷走神經(jīng)背核、前庭核）、小腦皮質(zhì)、脊髓（中間外側(cè)核）和錐體系。MSA包括Shy-Drager綜合征（Shy-Drager syndrome，SDS）、紋狀體黑質(zhì)變性（striatonigral degeneration，SND）和橄欖腦橋小腦萎縮（olivopontocerebellaratrophy，OPCA）三種類型

發(fā)病機(jī)制可能有兩條途徑：一是原發(fā)性少突膠質(zhì)細(xì)胞病變假說，即先出現(xiàn)以α-突觸核蛋白（α-synuclein）陽性包涵體為特征的少突膠質(zhì)細(xì)胞變性，導(dǎo)致神經(jīng)元髓鞘變性脫失，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡；二是神經(jīng)元自身出現(xiàn)α-synuclein異常聚集，造成神經(jīng)元變性死亡。

三、α-synuclein與MSA

膠質(zhì)細(xì)胞胞漿包涵體（glial cytoplasmicinclusion，GCI）是MSA最具特征的病理改變。GCI呈新月、火焰狀或橢圓，由松散聚集的細(xì)絲組成，可包裹細(xì)胞器。GCI主要絲狀成分是α-synuclein，α-synuclein的突變可能在疾病發(fā)生過程中產(chǎn)生作用。α-synuclein基因（SNCA）rs11931074、rs3857059和rs3822086位點多態(tài)性可增加MSA患病風(fēng)險。