柯薩奇病毒A16型感染小鼠模型

采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發生后肢癱瘓最終導致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現癱瘓后遺癥。

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發現以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經系統感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復制并傳播到腦組織的重要部位。

2.重癥小鼠模型組織病理學變化

運用組織病理學和免疫組織化學技術，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學觀察?？瞻讓φ战M小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學觀察（圖4），發現3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發生細胞源性水腫，神經元發生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經元變性壞死，出現紅色神經元，并可見衛星現象和嗜神經現象，腦干組織中的神經元發生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發生大面積間質性肺炎，間質增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發生大面積空泡變性。免疫組織化學檢測發現在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態變化（圖6）。結果發現，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發生某時間點的爆發性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發現重癥小鼠血清爆發性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調4倍；48 hpi重癥IL-13上調1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調4倍和87倍。以上數據說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發揮重要作用。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發現小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態。并且發現二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發現了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態。以上血氣結果結合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態。

5. EV71小鼠模型超微病理學變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質內含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細胞內可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內外膜和嵴突結構清晰可見（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發生退行性變，細胞內出現水腫，部分肌原纖維發生溶解，肌質中的胞漿內容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質電子密度降低，內室腫脹，嵴和膜結構模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化（圖9D）；骨骼肌細胞核固縮，染色質邊集，異染色質明顯增多，發生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經元胞漿中的細胞器豐富，內質網發達，平行或不規則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內外膜和嵴突結構清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經元細胞器豐富，內質網發達，線粒體豐富（圖10D）；神經元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內室腫脹(圖10E)；有髓神經纖維髓鞘發生層面分離，導致小泡性分離，呈現泡狀改變（圖10F）。

對照組脊髓前角神經元常染色質明顯，異染色質少，細胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經元胞質中線粒體豐富，內質網發達（圖11B）。感染組脊髓前角神經元中粗面內質網擴張，出現尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質增多，細胞器減少，粗面內質網和高爾基復合體呈現不同程度的擴張，細胞質呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導致粗面內質網脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數量減少（圖11C）。小膠質細胞包圍吞噬神經元細胞，呈現嗜神經現象（圖11D）。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內可見呈淺亮的常染色質和呈深色顆粒狀的異染色質，胞質少而薄，胞漿內可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質細密，異染色質少，粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器豐富（圖12B）；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質邊集，呈不規則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規則，染色質邊集，核周細胞質電子密度降低，粗面內質網、核糖體、高爾基復合體等細胞器減少，胞質出現細小空泡變（圖12E），嗜鋨性板層小體或出現排空現象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發生了間質性肺炎。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風險的病原，人類感染風險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

1. 動物癥狀觀察

動物自感染后第3天開始出現癥狀，表現為體重增長變緩、弓背豎毛、后肢行動遲緩至癱瘓、死亡等癥狀（圖1）。感染后第4天時，動物全部表現出后肢癱瘓、停止進食等癥狀，感染后第5天動物開始出現死亡，在10天內全部死亡。

2. 組織內病毒復制情況

感染后最初在外周血中檢測到CA16病毒，隨后，血液中病毒載量逐漸下降。各組織中病毒載量在第3天和第5天達到高峰，其中骨骼肌內病毒載量最高，在第3天可達到108 copies/mg組織，腦中病毒載量在第5天達到高峰，可達106 copies/mg組織，表明了病毒感染引發病毒血癥后，病毒經血液向組織擴散，并在組織內復制。腦內病毒的高峰期滯后于骨骼肌，表明病毒經肌肉內神經元逆向軸突傳遞至腦內，而非病毒經血液直接擴散至腦部（圖2）。

此外，在心臟、肝臟、肺、腎臟和脾中均可檢測到病毒核酸。

3. 病理改變

感染第5天時，處死動物，觀察各組織的病理改變。小鼠的肺、腎和脊髓內未見與病毒感染有關的病變。心臟內表現為局灶性心肌纖維變性壞死，少量炎細胞浸潤；肝內局部肝細胞發生輕度空泡變性，可見肝實質中發生輕度的髓外造血；脾臟髓外造血增多；骨骼肌的肌纖維腫脹、壞死斷裂、肌纖維之間可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，也可見巨噬細胞等炎性細胞、壞死性肌炎；腦內未見與病毒感染有關病變，發現輕度血管源性水腫，可能與缺血缺氧有關；部分腸上皮細胞出現空泡變性。

SPF級1-10日齡乳鼠，ICR、C57或Balb/c均可。

1. 病毒準備

CA16在人橫紋肌瘤細胞（RD）中培養、繁殖，采用凍融法釋放病毒，超速離心法富集病毒。毒株為shzh05-1，2008年分離自深圳市，GenBank存儲號為EU262658。

2. 實驗動物

可使用SPF級別的1-10日齡乳鼠，品系包括ICR、C57BL6J、Balb/c，母鼠自然哺乳，在動物生物安全二級實驗室內獨立飼養。

3. 病毒感染

根據預實驗確定感染劑量，10日齡乳鼠經輕度麻醉后，經腹腔注射2.5×107 TCID50 的CA16 shzh05-1,攻毒體積為100微升/只，空白對照組注射等量RD細胞上清。

4. 模型分析指標

（1） 癥狀觀察

感染后動物觀察14天，記錄體重變化、癥狀和死亡率。根據癥狀嚴重程度，參照以下標準對動物進行打分：

0，未見異常；1，豎毛；2，后肢遲緩無力；3.單后肢癱瘓；4，雙后肢癱瘓；5，死亡。

（2） 病毒檢測

分別在感染后第1天、3天、5天和7天處死動物，分離主要組織器官，提取RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測組織內病毒載量，記錄病毒復制情況。PCR引物序列為：CA16-F1: GAAAAACCCTCGACACACTAG；CA16-R1: ATCAGCGTCCTTGCAATACTCG (1095)

（3） 病理診斷

分別在感染后第3天、5天處死動物，分離主要組織器官，HE染色觀察病理改變。

手足口病是由腸道病毒引起的，以發熱和手、足、手足口病是流行于亞太地區的嬰幼兒常見傳染病?？滤_奇病毒A16型（CA16）和人腸道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原體之一，引發嬰幼兒手足口病及皰疹性咽峽炎，嚴重并發癥包括無菌性腦膜炎，而神經源性的肺水腫或肺出血是導致嬰幼兒死亡的原因之一。該病毒近年來在大陸地區的感染，已經造成了數十萬兒童感染，并不時伴隨有死亡病例，目前尚無臨床可以使用的疫苗和治療藥物。

CA16屬于微小RNA病毒科，腸道病毒屬。CA16感染主要引起自限性的手足口病，偶爾引起的神經系統并發癥包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹、神經源性肺水腫和心功能衰竭等，嚴重者可導致死亡。

CA16主要通過糞口傳播，病毒最初定植于鼻咽部或胃腸道粘膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，進而引起第一次病毒血癥。若機體免疫力差，病毒可擴散至全身組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，最終侵犯靶器官，如腦、腦膜、脊髓、心肌和橫紋肌以及皮膚黏膜組織，引起重癥病變。尸檢時主要病變為神經元壞死等。