D5R基因敲除鹽敏感性高血壓小鼠模型

動物癥狀觀察：

表現為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

1、D5基因敲除及高鹽飲食小鼠血壓情況

高鹽喂養8周后，通過左頸動脈插管法檢測小鼠的血壓，我們發現，Drd5多巴胺受體5受體敲出小鼠的血壓相比于野生型小鼠明顯升高。給予高鹽飲食之后，多巴胺受體5受體（Drd5）敲出小鼠進一步升高。而野生型小鼠的血壓沒有明顯升高。說明多巴胺受體5 （Drd5）受體敲出小鼠確實能夠參與小鼠血壓的調節。

2、D5基因敲除小鼠腎臟NA離子轉運蛋白的表達情況

為了進一步確定Drd5受體敲除后，小鼠腎臟鈉離子轉運蛋白表達情況，我們提取了D5+/+小鼠以及D5-/-小鼠腎臟組織的膜蛋白，我們發現與對照組D5+/+小鼠相比，基因敲除組D5-/-小鼠腎臟組織NaPi2、NCC、ENaC、NKA等蛋白的表達顯著升高。這說明D5受體缺失之后，腎臟鈉離子調控失調，致使大量鈉離子聚集，進一步誘發鈉水平衡失調以及高血壓的發生發展。

3、D5基因敲除小鼠NADPH氧化酶活性情況

為檢測D5受體對NADPH氧化酶的影響，我們用第六代的D5-/-和D5+/+小鼠作為研究對象。ROS作為EH病理生理發生的一個因素，在心血管系統、腎臟中，主要是由NADPH氧化酶產生，因此，我們比較分析了D5-/-和D5+/+小鼠腎臟NADPH氧化酶的表達和活性。P47 (分子量47kDa)是腎臟NADPH氧化酶的細胞漿內的一個組成多肽，為此，我們檢測P47的含量代表NADPH腎臟組織中的表達，結果顯示：D5-/-鼠腎臟P47的表達量約是D5+/+小鼠的2倍。

進一步對NADPH氧化酶的活性測定發現：D5-/-小鼠腎臟NADPH氧化酶的活性明顯高于和D5+/+小鼠，同時經DPI處理的標本，幾乎檢測不到NADPH氧化酶的活性，證明了檢測NADPH氧化酶活性方法的特異性。分析結果表明，多巴胺通過D5，受體抑制NADPH氧化酶的表達和活性。

4、D5基因敲除小鼠ROS產生的情況

NOX家族均可誘導ROS的產生，定位于質膜上，可感受細胞外刺激信號，是信號分子的ROS主要來源。因此我們檢測了腎臟組織膜蛋白NOX4表達的情況。蛋白印記結果顯示，D5-/-小鼠腎臟NOX4的表達顯著高于和D5+/+小鼠。腎臟NOX4的高表達也提示D5基因對腎臟ROS表達的調節作用，誘導腎臟組織損傷，進一步加劇高血壓的發生發展。

1.C57小鼠，名稱：C57，近交系（Inbred Rat）

品系來源 ：1)遺傳背景及亞系:1921年Ltle用 Abbg Lathrop的小鼠株雌鼠57號與雄鼠52號交配，而得C57BL6。亞系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。 (2)毛色基因標記：aa、BB、CC（黑色）

(3)主要遺傳學特征：a免疫學特征：一般飼養條件下免疫球蛋白的量隨年齡而增加，而到生后20個月時則1gG增長緩慢，無菌飼養的絕對量較低。gM水平較高，出生12月以后，有的個體超過80ug/mL。無菌飼養的動物lgM量比一般飼養的高。細胞免疫低下者少見，這可能與自發腫瘤少有關。b。形態學特征：在新生鼠中，雌鼠為16.8%，雄鼠3%為小眼或無眼癥。0.6%后肢可見多趾癥，另外水頭癥占2%4%，耳頭癥占0.4%，交合不全占3%。c生理學特性：有強嗜酒精性。對放射性照射為中等強度感應度，LD50為630+4R，將雄鼠皮膚移植到同系的雌鼠身上，約20日被排斥掉，這是因為在組織相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常顯著。d癌發生率：乳癌發生率低，為01%，白血病為7%-16%化學致癌成功率低，放射性照射較容易誘發肝癌。

2.高血壓對照小鼠：C57小鼠，名稱：C57，同類系（Consomic Rat）

3.誘導方法：D5-/-小鼠的獲得：首先獲得構件打靶載體，利用同源重組技術把新霉素抗性基因反向插人到129/sv小鼠胚胎干細胞有D5受體表達的第二細胞內環基因序列中，抑制D5基因的表達，然后把基因打靶后的胚胎于細胞注射到c57BL／6小鼠胚泡，繁殖培育后產生純合基因D5-/-.本實驗應用的D5-/-小鼠第六代3-6個月齡的小鼠，對照（D5+/+）小鼠作為對照。6月齡D5-/-小鼠及其對照D5+/+，分別給予高鹽飲食（4%的NaCl）和正常鹽飲食（0.4%的NaCl），連續8周，每周測量血壓。

高血壓是由多基因、多環境因素及個人不良習慣相互作用而導致的一種慢性復雜疾病，也是危害人類健康的主要疾病之一。鹽是高血壓的重要環境因素，個體對鹽負荷或限鹽呈現不同的血壓反應，因此存在鹽敏感性問題[1]。鹽敏感性是高血壓、心腦血管病和其它疾病（如哮喘、胃癌和腎功能不全等）發病及致死的一個潛在危險因素 [2]。因此在高血壓臨床診治過程中，考慮鹽敏感性將有利于對高血壓分類、危險分級以及對癥治療。

鹽敏感性通常涉及人口、種族、社會因素以及腎功能、激素水平和飲食習慣等[3]。不同種族和人群鹽敏感性個體的檢出率不同，而且血壓的鹽敏感性隨年齡增長而變化，特別是高血壓患者。鹽敏感性由Weinberger[4]給出定義：靜脈滴注2L生理鹽水，測量平均動脈壓（MAP），次日早晨給予低鈉飲食后再測量MAP，兩次MAP相差≥10mmHg為鹽敏感性，否則為鹽耐受性。Yatabe [5]定義鹽敏感指數（SSI）為低鹽和高鹽飲食后MAP的差值與低鹽飲食MAP的商，若SSI≥5%為鹽敏感性。

對于鹽敏感性高血壓患者，高鹽攝入引起血壓升高主要有兩方面原因：一方面是腎小管對Na+ 重吸收增加，導致水鈉潴留，血漿容量增加，從而血壓升高；另一方面是內源性哇巴因物質分泌增多，特異性抑制鈉泵，胞內鈉離子濃度增加，Na+/Ca2+交換體被激活，細胞內Ca2+ 濃度升高，最終導致血管平滑肌或心肌收縮，引起高血壓 [6].Drd5是多巴胺受體的五種亞型中最特異的受體之一，一種持久的自激活受體，與人類原發性高血壓和心肌病密切相關。有研究表明整體D5R基因敲除導致小鼠高血壓和代償性心臟肥大[7]。我們實驗室的研究也表明，Drd5基因敲除能夠誘導小鼠血壓的升高。