SIVmac251直腸途徑感染恒河猴模型

1.該模型制備比較成熟，國內外都有此模型，構建和評價指標一致，所以該模型應用廣泛，具有統一的操作規程。

2. 該模型制備的關鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養環境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫學應用價值。

1、1. SIVmac251直腸感染恒河猴血漿病毒載量結果

直腸途徑接種SIVmac251病毒后，恒河猴血漿病毒載量均轉為陽性，即在感染后病毒載量持續升高，14天病毒載量達到高峰，約107copies/mL左右，一直到35天均處于106-107 copies/mL的較高水平，隨后載量下降并維持在104-105 copies/mL這一水平。

圖1 SIVmac251直腸途徑感染恒河猴血漿病毒載量結果

Fig.1 The viremia (viral RNAcopies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaques infected intrarectallywith SIVmac251

1、 2. SIVmac251直腸感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值結果

感染猴CD4+/CD8+的比例在感染后出現持續下降，出現倒置現象。1006075和1007054分別于第14天、第21天將至最低點，數值分別為0.39和0.5。隨后1007054的CD4+/CD8+的比例回升至1，此后一直在0.9上下波動；而1006075回升至1，后又降至0.5，此后一直維持在該水平。

圖2 SIVmac251直腸途徑感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaquesinfected intrarectally with SIVmac251

1、 3. SIVmac251直腸感染恒河猴CD4+和CD8+細胞絕對數結果

兩只恒河猴CD4+細胞絕對數在SIVmac251感染后發生應激性增高，然后出現明顯的大幅下降，隨后又在短期內迅速反彈，并最終在40天前后達到相對穩定的狀態。外周血中CD8+細胞變化不盡相同，經過急性期的劇烈震蕩后，1007054猴在感染28天后水平基本穩定，1006075猴在感染28天后CD8+T細胞數量持續升高。

圖3 SIVmac251直腸途徑感染恒河猴外周血CD4+ 和CD8+細胞絕對數變化

Fig.3 TheCD4+ cell counts and CD8+ cellcounts (per l blood) in Chinese-original rhesus macaques infecte intrarectallywith SIVmac251

1、 實驗用病毒：感染毒株為SIVmac251中國恒河猴細胞適應株，中國恒河猴PBMCs滴定病毒原液TCID50滴度為5×104 TCID50/mL。

2、 感染動物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結果為陰性。所有感染動物必須在ABSL-3室中進行。

3、 感染方法：將麻醉好的實驗猴放在操作臺上，動物采取俯臥位以保證直腸粘膜充分暴露，緩慢將10000TCID50的SIVmac251病毒液2mL注入肛竇處，實驗猴保持此姿勢30min。

4、 SIVmac251直腸感染猴樣品采集和指標測定：在感染前和感染后3、7、10、14、21、28、35、42、56、70、84天采集EDTA抗凝血4mL，分別測定血常規、血漿病毒載量、CD4+/CD8+、CD4+和CD8+細胞絕對數。

5、 SIVmac251直腸感染猴血漿病毒載量的測定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實時熒光定量RT-PCR方法測定血漿病毒載量。

6、 SIVmac251直腸感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對數測定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標記EDTA抗凝全血淋巴細胞，流式細胞儀測定CD4+/CD8+比值，并根據血常規結果，計算出CD4+和CD8+細胞絕對數。

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統嚴重損害為特征的傳染性疾病，是20世紀危害人類健康和生命最嚴重的病毒性疾病之一。自美國CDC報道首例艾滋病后，到20世紀80年代中期艾滋病發展成為一個性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬人，2014年新增感染者200萬，2014年因艾滋病死亡120萬人。艾滋病在1985年傳入我國，截至2015年5月31日，歷年累計報告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關注的公共衛生和社會熱點問題，艾滋病的預防與治療也成為當代生物醫學研究的前沿熱點之一。

艾滋病動物模型簡介

艾滋病發病機制研、藥物和疫苗的保護性研究及評價等方面在很大程度上依賴理想的動物模型。人們發現HIV以后，用HIV感染過多種動物，但由于種種原因，結果并不理想。研究發現猴免疫缺陷病毒(SIV)感染實驗用猴的模型效果比較理想，表現為和AIDS的臨床表征，發病過程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物學特性也較其他動物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應用。

SIV是猴獲得性免疫缺陷綜合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，為典型的C型病毒粒子，基因組長度大約為9.2kb，基因組成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二個LTR以及同HIV類似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列順序同HIV完全一樣。目前國內外對SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因為這兩個病毒株能在多種獼猴屬動物身上引發致死性免疫缺陷綜合征，同時伴有CD4+淋巴細胞下降，繼發機會性感染病毒性腦膜腦病。這些都與人類AIDS類似。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動物模型的制備首先要考慮其實際應用價值，最好的動物模型可以最大限度的模擬人類疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為模擬同性間性傳播的感染方式，通過直腸粘膜上皮途徑感染，病毒直接感染M細胞、上皮細胞等。直腸的生理構造及上皮細胞厚度非常薄等特點，都使直腸感染較陰道感染容易發生。將病毒緩慢注入猴直腸內，可建立同性性傳播動物模型。