SIVmac251陰道途徑感染恒河猴模型

1.該模型制備比較成熟，國(guó)內(nèi)外都有此模型，構(gòu)建和評(píng)價(jià)指標(biāo)一致，所以該模型應(yīng)用廣泛，具有統(tǒng)一的操作規(guī)程。

2. 該模型制備的關(guān)鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養(yǎng)環(huán)境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統(tǒng)，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1、 臨床癥狀

實(shí)驗(yàn)猴在感染后14天出現(xiàn)食欲減退，并持續(xù)兩周左右，體重有所下降，有淺表淋巴結(jié)腫大。

2、 SIVmac251陰道感染恒河猴外周血病毒載量結(jié)果

S142猴經(jīng)SIVmac251陰道感染后10d檢出病毒載量陽(yáng)性，之后迅速上升，在14d達(dá)到高峰，峰值為6.48×107，隨后迅速下降（圖1）。分別經(jīng)三種不同途徑（靜脈途徑、直腸途徑和陰道途徑）感染的實(shí)驗(yàn)猴在SIVmac251感染后血漿病毒載量的變化趨勢(shì)基本一致，但病毒檢出時(shí)間稍有不同，首先是靜脈感染猴S153在3d檢出陽(yáng)性，其次為直腸感染猴S172在7d檢出陽(yáng)性，最后是陰道感染猴S142在10d檢出陽(yáng)性。

圖1 SIVmac251不同途徑感染恒河猴血漿病毒載量結(jié)果

Fig.1 Viral load in plasma of SIVmac251-inoculated rhesus monkeys bydifferent route

1、 SIVmac251陰道感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值結(jié)果

S142猴經(jīng)SIVmac251陰道感染后CD4+/CD8+比值持續(xù)下降到第7d開始回升，到第10d時(shí)出現(xiàn)一個(gè)反彈峰，隨后CD4+/CD8比值又繼續(xù)下降，直到28天時(shí)下降到最低點(diǎn)，發(fā)生比例倒置。在急性期，S142猴的CD4+/CD8+比值一直在1以下波動(dòng)。（圖2）。三只不同途徑感染的實(shí)驗(yàn)猴CD4+/CD8+變化趨勢(shì)基本保持一致，S172（直腸感染猴）和S142（陰道感染猴）倒置的比S153（靜脈感染猴）嚴(yán)重。

圖2 SIVmac251不同途徑感染恒河猴CD4+/CD8+比值

Fig.2 CD4+/CD8+ ratio of SIVmac251-inoculated rhesus by different route

1、 SIVmac251陰道感染恒河猴血漿抗體檢測(cè)結(jié)果

S142猴經(jīng)SIVmac251陰道感染后在第14d時(shí)血漿抗體均轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，在21d時(shí)血漿抗體滴度緩慢上升，到42d時(shí)開始急劇上升，直到第56d，血漿抗體最高到1:640（圖3）。靜脈感染猴S153在第10d時(shí)最早檢出陽(yáng)性，隨后抗體滴度平緩上升，直到第56d；直腸感染猴S172在第14d時(shí)血漿抗體均轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，在21d時(shí)S172血漿抗體滴度迅速上升，42d時(shí)S172開始急劇上升，直到第56d，S172最高到1:1280。

圖3 SIVmac251不同途徑感染恒河猴血漿抗體檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 The result of antibody in plasma after SIVmac251inoculate rhesus by different route

1、 實(shí)驗(yàn)用病毒：感染毒株為SIVmac251中國(guó)恒河猴細(xì)胞適應(yīng)株，病毒原液TCID50為2×107/mL。

2、 感染動(dòng)物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實(shí)驗(yàn)前體檢無(wú)異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關(guān)的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結(jié)果為陰性。所有感染動(dòng)物必須在ABSL-3室中進(jìn)行。

3、 感染方法：將麻醉好的實(shí)驗(yàn)猴放在操作臺(tái)上，動(dòng)物采取俯臥位，后肢抬高，暴露陰道口。用2mL預(yù)冷的無(wú)菌PBS清洗陰道。再將1mLSIVmac251病毒原液緩慢推入。實(shí)驗(yàn)猴保持此姿勢(shì)30min。

4、 SIVmac251陰道感染猴樣品采集和指標(biāo)測(cè)定：在感染前和感染后3、7、10、14、17、21、28、42、56天采集EDTA抗凝血4mL，分別測(cè)定血漿病毒載量、CD4+/CD8+比值及血漿抗體測(cè)定。

5、 SIVmac251陰道感染猴血漿病毒載量的測(cè)定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定血漿病毒載量。

6、 SIVmac251陰道感染猴外周血CD4+/CD8+比值測(cè)定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標(biāo)記EDTA抗凝全血淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+/CD8+比值。

7、 SIVmac251陰道感染猴血漿抗體測(cè)定：免疫熒光法（IFA）檢測(cè)感染猴血漿中的抗體水平。

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病，是20世紀(jì)危害人類健康和生命最嚴(yán)重的病毒性疾病之一。自美國(guó)CDC報(bào)道首例艾滋病后，到20世紀(jì)80年代中期艾滋病發(fā)展成為一個(gè)性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬(wàn)人，2014年新增感染者200萬(wàn)，2014年因艾滋病死亡120萬(wàn)人。艾滋病在1985年傳入我國(guó)，截至2015年5月31日，歷年累計(jì)報(bào)告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題，艾滋病的預(yù)防與治療也成為當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)之一。

二、艾滋病動(dòng)物模型簡(jiǎn)介

艾滋病發(fā)病機(jī)制研、藥物和疫苗的保護(hù)性研究及評(píng)價(jià)等方面在很大程度上依賴?yán)硐氲膭?dòng)物模型。人們發(fā)現(xiàn)HIV以后，用HIV感染過(guò)多種動(dòng)物，但由于種種原因，結(jié)果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)猴免疫缺陷病毒(SIV)感染實(shí)驗(yàn)用猴的模型效果比較理想，表現(xiàn)為和AIDS的臨床表征，發(fā)病過(guò)程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物學(xué)特性也較其他動(dòng)物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應(yīng)用。

SIV是猴獲得性免疫缺陷綜合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，為典型的C型病毒粒子，基因組長(zhǎng)度大約為9.2kb，基因組成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二個(gè)LTR以及同HIV類似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列順序同HIV完全一樣。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因?yàn)檫@兩個(gè)病毒株能在多種獼猴屬動(dòng)物身上引發(fā)致死性免疫缺陷綜合征，同時(shí)伴有CD4+淋巴細(xì)胞下降，繼發(fā)機(jī)會(huì)性感染病毒性腦膜腦病。這些都與人類AIDS類似。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經(jīng)血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動(dòng)物模型的制備首先要考慮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，最好的動(dòng)物模型可以最大限度的模擬人類疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為模擬異性間性傳播的感染方式，通過(guò)陰道粘膜上皮途徑接種病毒，病毒可能直接感染郎格漢斯細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物AIDS模型的研究中發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注入黃體酮可促進(jìn)SIV/SHIV傳播，而雌激素則抑制SIV/SHIV傳播，可能與這些激素能影響陰道壁厚度或通過(guò)IL-2等影響CCR5和CXCR4受體表達(dá)有關(guān)。在合適的生理周期或使用一定量的黃體酮的情況下，用導(dǎo)尿管將病毒緩慢注入猴陰道內(nèi)，可建立異性性傳播動(dòng)物模型。