先天性小兒畸形Foxi3敲除小鼠模型
討論與結論
生物安全性
評價驗證
foxi3敲除小鼠純合子胚胎有耳部畸形表型，外耳明顯小于正常，失去正常小鼠耳廓亞結構形態(tài), 外耳道未見，其耳廓形態(tài)與人先天性小耳畸形比較類似。
制備方法
利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進行基因敲除（knockout，KO），制備FOXI3敲除小鼠。小鼠的背景品系是C57BL/6。
(一)設計方案：
Foxi3forkhead box I3 [Mus musculus(house mouse) ]
Gene ID: 232077
Location: 6; 6 C1
Exon count: 2
（二）根據(jù)基因信息選擇靶點，合成sgRNA
targeting site 1:
tcccaggtataagagacg cgg
M-FOXI3-sgRNA-UP15’TAGGtcccaggtataagagacg
M-FOXI3-sgRNA-DOWN15’aaacCGTCTCTTATACCTGGGA
targeting site 2:
atcgctcctcagacttga tgg
M-FOXI3-sgRNA-UP25’TAGGatcgctcctcagacttga
M-FOXI3-sgRNA-DOWN25’aaacTCAAGTCTGAGGAGCGAT
(三)顯微注射
1，超數(shù)排卵：15只3-4周齡C57雌鼠注射激素進行超排。
2，受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
3，雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的ICR雄鼠。
4，受體鼠制備：8-10周齡ICR與結扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5，胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 150枚卵，5只受體鼠）。
(四)顯微注射基因型鑒定
1，剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
2，基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA
3，PCR檢測：根據(jù)序列信息設計檢測引物（上海英濰捷基）
M-FOXI3-ko-s 5’CAAATAAGTAGTCAATCCACTCAAACG 61.4℃
M-FOXI3-ko-a 5’TCCCACCCTTAACTCCAATGAC 62.3℃
M-FOXI3-wT-s 5’GGGCTGATTGATCTCTGAGTTC 60.2℃
M-FOXI3-wT-A5’AGGTGCTGAGGAAAGTGTTGAG 60.8℃
M-FOXI3-ko-s&A: TM=61℃ KO 603bp
M-FOXI3-wt-s&A: TM=60℃ WT 496bp
PCR反應體系及擴增程序（TaKaRaRR042A）
l反應體系：
10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)
2.0 μl
dNTP Mixture(2.5 μM)
1.6 μl
引物-S（50 μM ）
0.2 μl
引物-A（50 μM ）
0.2 μl
模板DNA
2.0 μl
LA Taq
0.2 μl
補加ddH2O至總體積
20.0 μl
l擴增程序：
l 6×loadingbuffer 終止反應。
l 用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。
研究背景
小耳畸形的病因目前還不完全明確，環(huán)境和遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的重點。先天性小耳畸形在基因突變致病性研究方面還沒有闡明小耳畸形胚胎發(fā)育的機制。小耳畸形主要涉及胚胎發(fā)育期間第一和第二鰓弓的異常，主要表型涉及外耳發(fā)育異常。外耳的耳廓是由第一和第二鰓弓的逐漸融合形成的，在發(fā)育過程中第一和第二鰓弓之間是相互作用，兩弓之間的凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的起源來分析，外耳的發(fā)育至少在一定程度上是由第一和第二鰓弓通過后腦的部分區(qū)域來介導的，后腦是鰓弓的神經(jīng)嵴細胞的來源，在后腦的第四段基因突變可以導致外耳的發(fā)育缺陷。
小耳畸形主要是指外耳的先天發(fā)育性結構異常，其嚴重程度主要表現(xiàn)為從輕度結構異常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狹窄和外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常， 畸形嚴重者耳廓全部消失， 絕大多數(shù)患者僅遺留花生狀或貝殼狀的殘耳組織。同時一些小耳畸形患者也常合并顱面部畸形，中耳及半側顏面骨及軟組織發(fā)育不良等。
FOXI3是轉錄因子Fox家族成員之一。受FOXI3調控的信號通路和基因很多，包括FGF、BMP、WNT等信號途徑及在胚胎發(fā)育過程中有重要作用的SIX、EYA和PAX等轉錄因子。研究顯示Foxi3敲除小鼠可檢測到Fgf3/8、Wnt8a、Eya1、Six1等基因表達異常；Foxi3敲除雞可檢測到Fgf2/3/19、Dlx5、Six1和Eya1等基因表達異常。Pax-Six-Eya-Dach是控制動物眼、耳、腦神經(jīng)和肌肉發(fā)生及發(fā)育的關鍵基因網(wǎng)絡。在斑馬魚和雞Foxi3敲除的模型胚胎中也檢測到類似人OAVS患者的表型。在人的樣本中，也有Tassano E等報道了1例具OAVS表型的女孩被鑒定到包含F(xiàn)OXI3基因在內的2.5Mb大小的染色體雜合缺失。
模型信息
中文名稱:先天性小兒畸形Foxi3敲除小鼠模型
英文名稱:NA
類型:先天性小耳畸形動物模型
分級:NA
用途:用于先天性小耳畸形疾病研究。
研制單位:中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院
保存單位:中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院
