慢性束縛應激誘導大鼠學習記憶障礙模型

束縛，是一種將動物置于無法逃脫的應激環境中，通過行為制動的方式，模擬人類社會中無法避免的擁擠、壓力性空間等應激因素。由于其對動物沒有電擊等物理性刺激，減少了動物的軀體應激反應，與獲得性無助、不可預測性應激等慢性心理應激模型相比，是建立單純心理應激所致學習記憶障礙更適宜的造模方法。慢性束縛，是持續時間較長的一種造模方式，一般造模時間大于1 d。更好的模擬了現代社會中，人們面臨的壓力持續時間增加的情況。本研究通過兩種不同的認知行為學評價方法考察束縛應激對SD和Wistar大鼠學習記憶能力的影響。水迷宮定位航行實驗是考察動物空間學習記憶能力的一種常用方法。結果表明慢性束縛應激(10 h，28 d)對SD大鼠空間學習記憶的損傷更明顯。新物體識別實驗是評價動物識別記憶的簡單、靈敏的方法。結果表明SD和Wistar模型大鼠在熟悉期表現出與各自對照組相同的探索能力，但是檢測期的辨別指數與對照組比出現差異。這排除了探索行為的改變對認知檢測結果的干擾，同時表明束縛應激對大鼠的識別記憶能力產生損傷，且對SD大鼠的損傷更明顯。水迷宮工作記憶實驗結果也表明慢性束縛應激對SD大鼠的非空間學習記憶能力的損傷較Wistar大鼠更明顯。兩種檢測方法中，水迷宮對動物的體力要求較高，其具體體現在游泳速度上。束縛應激在對速度的影響不顯著的情況下，可引起空間學習能力、工作記憶的損傷。進而表明體重下降只是應激引起的外周作用的一種表現，與學習記憶能力并沒有一定的相關性。

獎勵性操作條件反射是一種復雜的條件反射，它涉及到對反應與獎勵之間的操作行為后果因果聯系的認知。評價指標包括動物的踏板次數、鼻觸次數及完成任務所需要的時間。適應訓練過程沒有條件性刺激和踏板伸出，動物自由的探索測試箱。獎賞適應階段的鼻觸次數能夠反映出動物對獎勵物質的興趣程度。實驗結果發現，慢性束縛應激大鼠（6h和10h，28天）在適應訓練中的鼻觸次數、運動路程、平均速度和糖水消耗量與對照組比較均沒有顯著性差異，表明慢性束縛應激并不會損害動物的運動能力和對獎賞的興趣。

獎勵性條件反射訓練中，條件性刺激與獎賞（20%蔗糖水）反應配對出現，動物需要記住只有當藍色信號燈亮時才能夠獲得獎勵。慢性束縛應激（6h和10h，28天）嚴重的損傷了激勵性條件反射的習得，主要表現在慢性應激組動物的NPs 顯著性的低于對照組，說明了慢性束縛應激能夠損害動物的獎勵性條件反射的獲得。同樣應激組的NPs并沒有像對照組一樣表現出上升的趨勢， 其可能的原因是，由于慢性應激導致動物獲得獎勵的次數降低，進而降低了獎勵物質的內在價值，動物逐漸失去探索獎勵的動機，逐漸停止探索行為。

在獎勵性操作條件反射學習過程中：慢性束縛應激（6h和10h，28天）后，動物的LPs、NPs 和LP/NP 顯著性的降低。同樣實驗結果發現，慢性應激組大鼠表現出訓練 day1-4 NPs顯著性減少，day5-day10恢復正常，表明了訓練前給予慢性束縛應激嚴重損害了操作件反射的獲得。但是，通過增加訓練次數可能彌補這些損害作用。

動物是在形成操作式條件反射后接受慢性束縛應激，然后將動物按照起初的訓練環境引起記憶回放。慢性應激組LP/NP和完成任務需要的時間顯著性的低于對照組，說明了應激動物的記憶檢索能力受到一定程度的損害，這也說明了慢性束縛應激削弱了準確的回憶操作-后果關聯的能力。當獲取獎勵的規則改變時，動物需要重新付出努力再次學習新的踏板操作-后果之間的關聯反應。因此，我們利用高比率操作反應來評價這種行為靈活性。通過我們設定的獎勵獲取規則，動物僅在2（或 3 s）內連續踏板2次（或4次）才能獲取獎勵。慢性應激大鼠在訓練起初表現出踏板操作的盲目性和連續性，慢性應激大鼠獲得的獎勵和LP/NP 顯著性低于對照組，以及動物不能有效的將獎賞和一系列的踏板操作聯系起來，表現出持續性的效率低下。

此外，本實驗室和文獻均對不同時間慢性束縛應激引起的學習記憶障礙有所研究，即除上述實驗外，本課題組還探究了Wistar雌雄大鼠每天束縛6h，連續7天、14天、21天、28天和35天，利用水迷宮實驗和穿梭實驗進行對學習記憶能力的評價。結果顯示以上各組別的模型大鼠和對照組相比各指標都無差異，且模型組大鼠在某些時間點表現出相對對照組學習記憶能力增強的現象。雌性大鼠每天束縛10h，在第28天時，自主活動實驗模型組大鼠在水迷宮實驗第二天出現總總游程和總時間的延長，但第三天差異消失，這可以一定程度上反映大鼠每天束縛10h、連續28天可能會造成大鼠學習記憶障礙，但模型表現不穩定，需要加長每天束縛時間確保模型的可重復性。因此，將每天束縛時間延長至14h，利用水迷宮實驗、穿梭實驗、新奇事物實驗來評價模型大鼠的學習記憶能力。連續束縛28天后模型組雌雄大鼠在新奇事物實驗、水迷宮實驗中都表現出與對照組明顯差異，故認為雌雄大鼠在每天束縛14h連續28天后導致大鼠學習記憶障礙。且本次研究中慢性束縛應激（10 h/28 d），在新物體識別實驗和水迷宮實驗中SD大鼠學習記憶能力的損傷較Wistar大鼠明顯。另外，慢性束縛應激（6h和10h，28天）能降低Wistar大鼠在獎勵性操作條件行為學檢測中不同階段對記憶的主動操作能力、學習記憶獲得、維持、再學習能力。此外，課題組還報道了ICR小鼠經慢性束縛應激10h，28天損傷了動物在新物體、物體位置識別實驗和水迷宮行為學實驗中的學習記憶能力，與對照組相比具有顯著性差異。故我們推薦慢性束縛應激10h和14h，28天致使SD和Wistar大鼠新奇事物實驗、水迷宮實驗中的學習記憶損傷，且14h，28天造模時間更穩定。慢性束縛應激（6h和10h，28天）均能降低Wistar大鼠在獎勵性操作條件行為學檢測中不同階段對記憶的主動操作能力、學習記憶獲得、維持、再學習能力。慢性束縛應激10h，28天致使ICR小鼠在物體識別實驗（新物體和物體位置）和水迷宮實驗中的學習記憶損傷。

分子機制結果表明長期束縛應激（6h和10 h/day，28 days）均可引起大鼠BDNF表達減少，繼而引起GR介導的BDNF 信號轉導受阻。此外Egr-1和Synapsin-1等蛋白表達均明顯的降低。神經遞質檢測發現應激組大鼠前額皮層Ach，E和NE無變化，Glu 顯著性升高，5-HT的含量降低。氧化應激檢測發現慢性束縛應激10h，28天可引起ICR小鼠血清中丙二醛含量的升高以及降低總抗氧化能力。

模型技術難點在于由于束縛器是樹脂材料的圓柱形，頂端有數個通氣的小孔，各組動物體重的控制應在適宜范圍之內，滿足其在束縛器中身體不能翻轉，只能保持頭部活動保持正常呼吸。另外，在束縛早期由于動物掙扎劇烈，會出現動物窒息的情況，所以一開始需要我們24 h觀察，及時排除動物窒息死亡的情形。

與其他應激模式不同：慢性束縛應激是將動物置于無法逃脫的應激環境中，通過行為制動的方式，較好的模擬了宇航員在太空中飛行和現代人類社會長期處于擁擠、狹小空間作業而引起的認知損傷。

本實驗采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1 實驗材料

（1）藥品與試劑：

BDNF，TrkB，Erk1/2，Egr-1，GR和Synapsin-1 rabbit mAb（Cell Signaling）

（2）儀器：

① 行為學檢測：大鼠水迷宮計算機監測分析系統、物體識別檢測箱、獎勵性操作條件反射測試箱

② 蛋白含量檢測：制冰機（意大利Icematic公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）、電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、離心機（德國Eppendorf公司）、全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）、超聲細胞破碎儀（美國Sonics公司）、TS-1脫色搖床（江蘇海門其林貝樂公司）、雙垂直板電泳槽（美國Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝膠成像（美國Bio-Rad公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價方法

（1）行為學評價:

① 水迷宮空間記憶實驗

本實驗中，圓形迷宮直徑為 159 cm、高 50 cm， 池中水深25. 5 cm 左右，內置平臺直徑 9 cm、高 24 cm，水溫維持在( 24 ± 1) ℃。將迷宮置于空間信息相對豐富的實驗環境中，作為動物學習過程中的空間參照物，整個試驗周期內保持環境信息固定不變。將迷宮均分為4個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實驗中動物逃離水環境的唯一途徑，空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余3個象限作為動物的入水點將動物面向池壁放入水中，每天訓練 3次，每次變換入水點位置(使動物可分別從3個象限入水) ，且每天所有動物入水點的順序保持一致。每次訓練前適應 10 s，使動物獲取并學習空間環境信息。設置檢測時間為60s后，將動物放入水中，若動物在60 s內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息10 s。若動物在 60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為60 s，并引導動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓練的時間間隔為40 min。每天每只動物3次訓練學習的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學習能力的指標。經過5d的訓練學習后，第6天撤去平臺，進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中， 檢測其在60s內在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數，作為評價空間記憶能力的指標。

② 水迷宮工作記憶實驗

空間探索實驗結束次日，開始工作記憶實驗。工作記憶歷時3d，分別將平臺置于其余 3 個不同象限中，每天變換平臺位置，同一天內平臺位置保持不變。每天訓練3次，依次從其余3個非平臺象限將動物面朝池壁放入水中。訓練前不予適應，其余同空間訓練階段一致。計算3天中，第2次訓練潛伏期的平均值，作為評價動物學習記憶能力的指標。

③ 新物體識別實驗

實驗箱為黑色聚酯塑料材質構成的封閉箱，體積為60 cm × 40 cm × 80 cm， 箱體左右兩側各有兩排LED燈條照明， 既避免了強光直射對動物行為的干擾，又可以作為計算機對動物行為識別的背景光。頂部采用攝像頭觀察動物的活動情況及探索過程。實驗過程分為3個階段: 適應期、熟悉期、測試期。適應期為 3d， 每天將動物依次放入實驗箱內，熟悉環境10 min。適應期結束后，次日進行熟悉和測試。熟悉期時，將兩個完全相同的物體放入實驗箱內對稱的位置處，此兩物體距離側箱壁、箱后壁的距離均為10 cm。記錄大鼠5 min 內對兩物體的探索總時間。間隔30 min后，進入測試期。測試期內，將其中一個熟悉物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體， 記錄大鼠對新穎物體和

熟悉物體的探索時間，用辨別指數 (discriminationindex，DI) 來評價動物的學習記憶能力。辨別指數計算公式為 DI = ( N-F) /( N + F) × 100%，其中N( new) 為新穎物體探索時間，F( familiar) 為熟悉體探索時間。

此外基于該模型行為學評評價方法包括獎勵性操作條件反射實驗步驟如下：

① 適應模式：

束縛 28 d 后將動物放進測試箱內進行適應訓練， 其方法為：束縛大鼠去除束縛器后，在動物籠內恢復 30 min，恢復期間將動物搬進測試箱房間內，適應測試間的環境 30 min。 30 min 后將大鼠按照順序放進測試箱內，打開操作系統，進入自由適應模式， 將亮燈時間調整為 0 s，即試驗中沒有信號燈的指示。獎賞物質每 60 ±10 s 自動給出，動物在測試箱內自由的探索，并做出鼻觸反應獲取獎勵。適應期間記錄動物鼻觸次數及運動路程、平均速度指標。

② 獎勵性條件反射實驗:

利用獎勵性條件反射測試系統，對造模實驗動物進行檢測。應用自由適應模式，此模式為信號燈亮，獎賞物質給出。以動物探頭次數（NP）為評價指標。動物探頭喝水反應了動物對飲水盒的位置記憶與探索興趣程度，此階段訓練的目的使動物得到獎賞物質可在飲水盒內獲得的信息；使動物將信號燈亮與獎賞物質之間形成經典條件反射。

③ 獎勵性操作條件反射

獎勵性條件反射訓練結束后，采用連續強化方式，即完成踏板操作1次即可獲得一次獎勵，直到獲得50次獎勵或者 30 min 試驗時間結束。

④ 獎勵性操作條件反射鞏固再現及復雜操作

當動物連續3 天在規定的 30 min 內成功獲得 50 次獎賞，此算做習得獎勵性操作條件反射，然后可以終止實驗進行下一步的實驗（FR=1）；連續多次踏板操作是指要求動物連續踏板2 次或者 4 次才能獲得 1 次獎賞，而連續踏板要求在2 s 或4 s內完成。

（3）蛋白含量檢測

① 組織蛋白的提取

每組各3個海馬組織，稱重，每10mg組織加入100 μl預冷的裂解液；冰上超聲破碎，制成10%組織勻漿。再置冰上裂解30 min：將組織勻漿液轉移到1.5ml離心管，4℃離心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法測定蛋白濃度；加4x上樣緩沖液，沸水浴變性5min，快速冷卻，分裝，-80℃凍存備用。

② SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制分離膠。將分離膠注入垂直放置的玻璃板縫隙中，頂層加入1cm高度的異丙醇覆蓋膠面。室溫靜置至凝膠與異丙醇之間有一水平的清晰界面，倒掉異丙醇，用濾紙凝膠頂部液體。配制濃縮膠。將配好的濃縮膠注入玻璃板問隙。立即插入齒梳，室溫靜置30 min左右。電泳。將凝膠插入垂直電泳槽中，小心拔出梳子，加滿電泳緩沖液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和樣品（8μl/孔）；電壓80 V，當溴酚藍進入分離膠后,將電壓增至120V，繼續電泳至溴酚藍接近分離膠底部。關閉電源，取下凝膠，進行轉膜。

③ 轉膜

按照凝膠大小，剪PVDF膜和兩張Bio-RAD專用濾紙，將剪好的濾紙，海綿墊和夾子在電轉移緩沖液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在轉膜夾中，從負極（黑色）到正極（白色）依次排放：海綿墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—海綿墊，蓋好正極板，插入電轉移槽，倒入電轉移液，蓋上蓋；冰浴電轉，350mA, 1h。

④ 封閉及抗原抗體反應

電轉完畢后，將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖1h。將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，4℃過夜。一抗雜交后用10%TBST洗10 min，每次溫振搖，共3次。洗滌后，將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，室溫孵育1h。二抗雜交后用10%TBST洗滌10 min，每次室溫振搖，共３次。將A液和B液按1：1比例混勻配制化學發光液，避光保存；將膜放于剪好的自封袋中，均勻滴加發光液，暗處放置3min；置于凝膠電泳顯色儀中照相。

(4) 神經遞質檢測

腦組織中神經遞質的檢測采用LC-MS/MS分析方法，可同時測定7種腦內神經遞質的含量，其中單胺類神經遞質包括多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）和 5-羥色胺（5-HT），膽堿類神經遞質主要是乙酰膽堿（Ach），

氨基酸類神經遞質包括興奮性氨基酸（谷氨酸 Glu）和抑制性氨基酸（氨基丁酸，

GABA）。

3 評價結果

（1） 行為學結果

① 慢性束縛應激對水迷宮實驗（空間探索階段）的影響

②慢性束縛應激對水迷宮實驗（工作記憶階段）的影響

③慢性束縛應激對新物體識別的影響

此外，本課題組還針對Wistar大鼠的慢性束縛應激（6h和10h/28天）誘導的認知損傷進行探究，行為學檢測主要包括獎勵性操作條件反射，結果如下所示：

① 慢性束縛應激對大鼠的興趣及運動能力的影響

各組別的運動路程及平均速度均沒有明顯變化，這同樣說明了慢性束縛應激對大鼠的運動能力和探索興趣也沒顯著性影響。行為學檢測結束后，我們進行了糖水攝取實驗，即給予動物 20%蔗糖水，自由飲水 1 h，從實驗結果看到三個組別的糖水消耗量沒有明顯的變化。此結果再次驗證了上述結論。

① 慢性束縛應激損害大鼠獎勵性操作條件反射學習能力

慢性束縛大鼠的踏板次數、鼻觸次數顯著性低于對照組。但隨著訓練周期的延長大鼠的踏板次數逐漸的升高，并在訓練第8天與對照組無明顯的差異，因此也致使大鼠的學習效率（LP/NP）呈現逐漸升高的趨勢，同樣在第 8天基本達到正常水平。以上結果說明了慢性束縛應激阻礙了大鼠的學習能力，隨著訓練強度的加大可以彌補這種損害作用。

③慢性束縛應激對大鼠獎勵性操作條件反射記憶鞏固的影響

④慢性束縛應激對大鼠的復雜操作能力的影響

本實驗采用的連續多次踏板操作來檢測大鼠的復雜操作能力。實驗結果如圖8。結果顯示，在固定比率2和4階段，各項指標均出現顯著性的差異。在 FR=2 階段，與對照組比較，束縛 6-h 組的踏板次數、鼻觸次數指標首先出現顯著性差異（day 1）；反應動物踏板操作準確性的指標如 R/NP，R/LP，LP/NP等均在 day 2 出現顯著性差異。束縛 10-h 組表現出與束縛 6-h 相似的作用。FR=4階段，與對照組比較，束縛 6-h 組的踏板次數、鼻觸次數、獎賞次數以及比率（R/NP，R/LP，LP/NP）均表現出顯著性的差異；束縛 10-h 組則在鼻觸次數（day 2，day3）、R/LP（day 2，day 3）、潛伏期（day 2）出現顯著性差異。從下圖同樣可以看出，隨著訓練周期的增加，動物的踏板次數、獎賞次數以及操作任務的準確性均在逐漸的升高。綜上所述，慢性束縛應激可以損害大鼠復雜操作能力，但這種損害作用可以通過大量的操作任務訓練來彌補。

圖 8. 慢性束縛應激對大鼠的復雜操作能力的影響 (n=7-10，Mean±SEM）。與對照組比

較，*p<0.05，**p<0.01, ***p<0.001有顯著性差異。

（2）蛋白含量檢測結果

如圖9所示，慢性束縛應激（6 h/day, 10 h/day）顯著性的減少皮層中糖皮質激素受體（GR）的表達 (p<0.001)。

圖9. 慢性束縛應激對大鼠前額皮層內GR蛋白表達的影響（n=3, mean±SEM）。與對照組比較，***p<0.001。

如圖10所示，CRS 6-h和CRS 10-h 組別均顯著性的降低皮層中BDNF的表達(p=0.002)，BDNF特異性的受體TrkB的表達也顯著性降低(p<0.001)。BDNF是神經營養因子家族中的一員，與其高親和力受體TrkB結合引起下游MAPK信號級聯反應在神經細胞的生存、分化、維護生理功能以及認知功能等方面起到重要作用。束縛應激大鼠皮層中總Erk1/2沒有變化，但其磷酸化水平顯著性降低（p<0.001）。

圖10. 慢性束縛應激對大鼠前額皮層內BDNF/TrkB/Erk1/2通路蛋白表達的影響（n=3,mean±SEM）。與對照組比較，**p<0.01，***p<0.001。

如圖11，結果表明，應激組動物皮層內 Egr-1 蛋白表達明顯的低于 Con組別，差異顯著（p<0.001）。

圖 11. 慢性束縛應激對大鼠前額皮層內 Egr-1 蛋白表達的影響（n=3, mean±SEM）。與對照組比較，***p<0.001。

如圖12顯示，與 Con 比較，大鼠經歷 28 天的慢性束縛應激后，皮層中Synapsin-1的表達顯著性的減少 (CRS 6-h, p<0.001; CRS 10-h, p<0.001)

圖 12. 慢性束縛應激對大鼠前額皮層內 Synapsin-1 蛋白表達的影響（n=3, mean±SEM）。與對照組比較，***p<0.001。

（3）神經遞質檢測

如圖13，慢性束縛應激 28days 后，大鼠皮層中Ach的含量沒有發生顯著性的變化（p>0.05）。慢性束縛應激顯著性的升高皮層內興奮性氨基酸（Glu）的含量，其中 CRS 10-h（p=0.002）較 CRS 6-h（p=0.02）升高較多，抑制性氨基酸（GABA）則沒有明顯的變化。慢性束縛應激對 E 和 NE 無明顯影響，但可以顯著性降低 5-HT的含量，并顯著性升高 DA 含量。

圖 13. 慢性束縛應激對膽堿類神經遞質 Ach、Glu、GABA、DA、NE、E和5-HT含量的影響（n=6, mean ±SEM）

1 動物：SPF級SD、Wistar大鼠和ICR小鼠

2 材料：行為限制器、醫用棉簽

3 儀器：無

4 模型誘導方法：

慢性束縛組大鼠每天早上9:00開始束縛，束縛強度為6h和10h，連續束縛 28天。束縛時將動物放進大鼠束縛器內（直徑6.0 cm，長21.0 cm），用底座固定，保持大鼠四肢固定，不能自由轉身。束縛器頂部及四周有數個孔洞，以保持束縛器內空氣流通，以防動物窒息死亡。束縛期間，模型大鼠放在臨近的隔壁房間，正常組與束縛大鼠隔開，去除束縛后再放回原來的動物籠中。

應激是人類所處生活環境中普遍存在的一種外界因素[1,2]?，F代快節奏的生活、高強度的工作及各種特因環境等應激對機體造成嚴重的生理和心理上的改變，尤其是對認知能力的改變已成為影響人類身心健康的主要因素之一[3]。束縛，是一種將動物置于無法逃脫的應激環境中，通過行為制動的方式，模擬人類社會中無法避免的擁擠、壓力性空間等應激因素，是目前建立單純心理應激所致學習記憶等神經精神疾病應用最廣泛的造模方法之一[4]。

文獻中關于建立該模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束縛應激動物模型都采用常用的模式動物, 如大鼠和小鼠。多選用封閉群 Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[5-9]。雄性多見。造模周期為14-48 d不等[10]，本研究在前期實驗研究和文獻的基礎上，選用10h/28d慢性束縛應激對Wistar和SD大鼠的學習記憶損傷進行比較研究；另選用Wistar大鼠進行慢性束縛應激造模6h和10h/28d觀察對動物學習記憶損傷的影響。確定該模型誘導的認知損傷模型為航天特因環境及現代人類長期處于狹小環境作業誘發的學習記憶障礙機理研究、防護和藥物研究提供實驗模型。

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