自閉癥家犬Shank3敲除模型

病理體征：

1、孤獨癥合并癥：

（1）運動能力：跑步機實驗證明突變犬均存在不同程度的運動協調能力損傷，此外所有突變體都不能夠爬樓梯，突變體均運動協調能力異常。

（2）活動與睡眠：通過活動監控儀實施24小時活動監測，發現Shank3突變犬夜間活動增加，睡眠碎片化；睡眠時間縮短，睡眠質量差。

2、孤獨癥核心癥狀：

（1）狗狗同類社交：

單箱實驗：同類社交“單箱”實驗結果顯示：突變犬與陌生犬社交（嗅探、邀玩）時間明顯減少，甚至出現夾尾、退縮等社交壓力的表現，突變體在狗與狗社交能力方面存在缺陷。

（2）狗與人異類社交：

“求助”實驗：突變犬與人的社交互動明顯減少，在“困境”時無法及時的通過眼神交流向人類發出求助，社交依賴性比較弱，社交缺陷。

（3）刻板行為：突變體在沒有皮膚炎癥的情況下，自我抓撓、舔舐、刨籠子等行為明顯增多，刻板行為明顯。

Shank3基因編輯犬純合F0代和雜合F1代在同類犬犬社交（經典的“三箱”實驗）、異類犬人社交中均存在社交缺陷（社交時間減少、社交壓力增加）、刻板重復性行為等孤獨癥核心癥狀；此外模型犬同樣存在運動能力減弱、睡眠障礙等合并癥狀。以上表型較好的重復了臨床孤獨癥患兒表型，是較為理想的孤獨癥研究的疾病動物模型。

創新性：

1、本項目為首次利用基因編輯技術構建神經精神疾病家犬模型。

2、與非人靈長類猴相比， 家犬的基因編輯技術成熟、成本低、繁殖發育快、便于表型分析。

3、家犬作為人類的伴侶動物，性情溫順，社交行為豐富，特別適用于社交與情感方向的研究。

4、本項研究既有利于解析社交與情感這一重大神經和認知科學難題，也有利于重大精神疾病的病理機制解析，推動臨床轉化。

應用價值：

一、 利用模型犬，開展相關課題研究，通過行為學表型、腦影像、分子檢測分析，深入研究孤獨癥發病機制機理；

二、 利用模型犬，通過腦影像、分子檢測分析，為孤獨癥客觀診斷標準的制定提供依據；

三、 利用模型犬，開展相關藥物有效性評價與新藥研發實驗：

1.評估藥物對孤獨癥刻板行為的影響；

2.評估藥物對社交障礙的影響；

3.評估藥物對睡眠、運動能力、注意力障礙的改善；

四、利用模型犬，開展非藥物治療有效性實驗與評價：

1.評估醫療器械、康復理療儀器對孤獨癥的治療效果；

2.評估外科手術、腦電干預對孤獨癥的治療效果；

3.評估干細胞對孤獨癥的治療效果；

4.評估社交訓練等行為學教育對孤獨癥的治療效果。

北京希諾谷生物科技有限公司具備實驗動物使用許可資質SYXK（京）2016-0049，模型制備過程中不涉及病毒等生物活性物質。動物模型的制備、應用、處置均接受倫理委員會的監督。飼養及實驗環境符合國家標準。相關設施運作過程中充分考慮防疫和人員保護要求。

背景信息：

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)存在于所有族群中，平均患病率約1%。孤獨癥譜系障礙是一類神經發育疾病，不同孤獨癥患者在自主生存能力、認知和語言能力以及并發癥上存在巨大的表型異質性 (Lord et al., 2000)，主要有兩大核心癥狀，即社會交流障礙和刻板重復性行為。這些癥狀在兒童早期出現并影響日常生活能力。孤獨癥影響到越來越多的家庭，帶來巨大的經濟負擔和精神壓力，已成為一個公共健康問題。因此我們需要積極尋找孤獨癥的致病原因，根據孤獨癥的致病基因構建動物模型，闡明孤獨癥的發病機制，為疾病的有效診斷和早期干預提供科學依據。

基因信息：

SHANK3是目前研究最深入的幾個孤獨癥致病基因之一，該基因突變導致的病例約占孤獨癥譜系障礙總病例的1%。含有SHANK3染色體區域的大片段缺失會導致22q13.3缺失綜合癥 (Phelan-McDermid Syndrome, PMS)。22q13.3缺失綜合癥病人缺失片段的大小可以從0.1 Mb到10 Mb不等，臨床癥狀主要為肌肉張力減退、發育遲緩、語言缺失或滯后以及智力障礙，其中75%的病人也被診斷為孤獨癥譜系障礙。

通過對家犬的全基因組序列分析，發現在家犬中Shank3基因結構與小鼠和人類相似，全部具有22個外顯子。 家犬Shank3基因第21號外顯子編碼一個富含脯氨酸的保守區域，該區域是孤獨癥患者發生突變的熱點。因此，我們針對第21號外顯子進行基因編輯（sgRNA 2和3），同時針對第5和第21號外顯子兩個位點（sgRNA 1和3）誘導Shank3的無效等位基因。目前公司擁有Shank3 21號外顯子片段刪除、5~21號外顯子33Kb大片段刪除的F0代以及不同基因類型的大量雜合F1代。

1、制備SHANK3基因敲除自閉癥模型犬共需要實驗用比格犬約100只，主要作為受精卵的供體和代孕母犬。實驗犬的環境符合中華人民共和國國家標準GB14925-2001《實驗動物環境及設施》要求。

2、制備SHANK3基因編輯模型犬，通過受精卵胞質注射完成。顯微操作環境對空氣的潔凈度要求為10萬級。用到的顯微操作系統包括倒置熒光顯微鏡（Nikon, eclipse ti-u）和顯微操作臂（nikon,NT-88-V3）。

3、制備SHANK3基因敲除模型，采用Cas9/CRISP基因編輯技術，主要的技術路線如下：判斷母犬發情，進行配種，手術獲得受精卵；通過顯微注射將體外轉錄的cas9 mRNA和sgRNA同時注射到受精卵的胞質中；將注射過的受精卵移植到同期發情的代孕母犬的輸卵管中；代孕母犬妊娠/分娩，得到F0代基因編輯犬；對F0代進行基因鑒定，篩選基因編輯陽性犬；通過繁育，獲得SHANK3基因編輯雜合子和純合子。

自閉癥研究概況

美國精神科醫師Kanner在1943年首次報道了11例自閉癥病人。自閉癥(autism spectrum disorder, ASD)存在于所有族群中，平均患病率約1%。自閉癥是一類神經發育疾病，不同自閉癥患者在自主生存能力、認知和語言能力以及并發癥上存在巨大的表型異質性 (Lord et al., 2000)，主要有兩大核心癥狀，即社會交流障礙和刻板重復性行為。這些癥狀在兒童早期出現并影響日常生活能力。自閉癥影響到越來越多的家庭，帶來巨大的經濟負擔和精神壓力，已成為一個公共健康問題。因此我們需要積極尋找自閉癥的致病原因，根據自閉癥的致病基因構建動物模型，闡明自閉癥的發病機制，為疾病的有效診斷和早期干預提供科學依據。

自閉癥的致病原因仍有很多未知，多認為遺傳因素起了主要作用，同時受環境因素影響。SHANK3是目前研究最深入的幾個自閉癥致病基因之一，該基因突變導致的病例約占自閉癥總病例的1% (Jiang andEhlers, 2013)。含有SHANK3染色體區域的大片段缺失會導致22q13.3缺失綜合癥 (Phelan-McDermid Syndrome,PMS)(Wilson et al., 2003)。22q13.3缺失綜合癥病人缺失片段的大小可以從0.1 Mb到10 Mb不等 (Dharet al., 2010)，臨床癥狀主要為肌肉張力減退、發育遲緩、語言缺失或滯后以及智力障礙，其中75%的病人也被診斷為自閉癥 (Jiang and Ehlers, 2013)。上述SHANK3相關疾病是因為雜合突變造成的單倍劑量不足，SHANK3所在區域兩倍或三倍重復增加的病例被診斷患有自閉癥、注意缺陷多動障礙 (Attention-deficithyperactivity disorder, ADHD) 以及精神分裂癥 (Failla et al., 2007; Moessneret al., 2007)，說明SHANK3劑量增加也會導致相關疾病。SHANK3基因的突變和橫跨SHANK3區域的大片段重復都會引起一系列神經精神疾病，表明合適的SHANK3劑量對正常的大腦功能至關重要。

為了研究SHANK3突變的致病機制，研究者開發了不同動物模型。基因突變小鼠模型是研究人類SHANK3突變相關的疾病發病機理的主流途徑，目前已開發出14種不同突變類型的小鼠品系 (Zhao et al., 2017)，但其表型由于突變位點的不同而各有差異。Shank3突變小鼠的研究提示，突觸水平的缺陷是自閉癥病理機制的核心。最早的Shank3基因突變小鼠缺失了編碼ANK結構域的序列 (外顯子4-9或4-7缺失) (Bozdagi et al., 2010; Peca et al.,2011; Wang et al., 2011)。對這些Shank3突變小鼠研究發現，海馬體CA1神經元突觸后功能和可塑性異常，小鼠社交行為減少，新生小鼠超聲發聲減少 (Bozdagi et al., 2010)。姜永輝教授實驗室長期致力于開發Shank3小鼠突變體模型 (Wang, X. etal., 2016; Wang et al., 2011)，并在轉錄水平對Shank3基因進行了詳細的分析 (Wang et al., 2014)。在缺失外顯子4-9的Shank3純合突變小鼠中，觀察到異常社交行為，刻板重復行為以及異常的學習記憶，紋狀體PSD組分中Homer1b/c、GKAP和GluA1的表達水平降低，而在海馬未發現類似的變化 (Wang et al.,2011)。在缺失了外顯子13-16 (編碼PDZ結構域)的小鼠模型中，Shank3主要蛋白亞型缺失，突變體表現出重復理毛行為和社交缺陷 (Peca et al., 2011) 。

由于基因編輯技術在非人靈長類的成功應用，近年來猴也被用于研究自閉癥的模型（Liu et al., 2016; Chen et al., 2017; Zhao et al., 2017）。由于猴的繁殖周期長，成本貴，表型檢測相對困難，因此難以廣泛用于疾病模型研究（Zhao et al., 2018），因而有必要開發新的的自閉癥動物模型。

（1）狗的社交行為和腦區功能與人類類似

狗在3萬3千年前左右開始在東亞的南部地區逐漸被人類馴化，馴化過程中最為顯著的特點是行為的轉變，特別是從懼怕人類到適應并相信人類 (Wang et al., 2013; Wang et al., 2016)。作為第一個被馴化的動物，狗在馴化過程中的心理已經變化，狗擁有狼所不具有的與人聯系的方式 [1]。即使是小狗，也可以自發地對人類手勢做出反應，例如指點線索，以找到隱藏的食物或玩具獎勵，相比之下類人猿必須有豐富的經驗才能表現出類似的技能[2]。寵物狗與工作犬相比有更強的社會依賴性，說明在狗的馴化過程中最重要的結果是狗傾向作為一個社會單元與人互動[3]。狗的面部表情的變化與主人是否注意有關，而與食物的刺激無關，說明狗在積極地與人類進行溝通[4]。2012年，Gregory S. Berns等訓練了兩只狗在沒有鎮靜劑或物理限制的情況下采集高質量功能核磁共振（fMRI）圖像 [5]。2013年他們將訓練的犬數目擴大到13只，再次證實犬核磁共振是可行的 [6]。用同樣的聲樂和非聲樂刺激人類和狗，發現狗對聲音產生反應的腦區和人類的前顳語音相關的區域相似 [7]。這些狗的社會行為學研究和腦影像研究揭示了狗與人類腦功能對比研究對揭示人類認知、情感交流機制以及神經和精神疾病發病機理等具有重要的科學價值。

（2）家犬基因編輯與克隆技術進展

不同于小鼠、牛、羊等生物，狗一直被認為是世界上最難被克隆的動物之一，2005年，世界首例體細胞克隆犬“史努比”在韓國誕生(Lee et al., 2005)。2015年，中科院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學教授在世界上首次成功應用CRISPRs/Cas9系統對狗的Myostatin基因進行基因編輯，該基因編碼肌肉生長抑制素 (Zou et al.,2015)。2018年, 馮沖等也利用此系統對ApoE基因進行編輯，成功得到純合突變體, 而且對此基因編輯狗成功進行了克隆（Feng et al.,2018)。ApoE在脂質的運輸和代謝中發揮主要作用，這一基因被敲除造成狗的血漿膽固醇升高，可能誘發動脈粥樣硬化。我國在家犬基因編緝和克隆狗的構建方面走在世界前列。

參考文獻:

Berns, G.S., Brooks, A., and Spivak, M. (2013).Replicability and Heterogeneity of Awake Unrestrained Canine fMRI Responses.Plos. One 8, e81698

Berns, G.S., Brooks, A.M., and Spivak, M. (2012).Functional MRI in Awake Unrestrained Dogs. Plos. One 7, e38027

Berns, G.S., Brooks, A.M., and Spivak, M. (2015).Scent of the familiar: An fMRI study of canine brain responses to familiar andunfamiliar human and dog odors. Behav. Process. 110, 37-46.

Bozdagi, O., Sakurai, T., Papapetrou, D., Wang, X.,Dickstein, D.L., Takahashi, N., Kajiwara, Y., Yang, M., Katz, A.M., Scattoni,M.L., et al. (2010). Haploinsufficiency of the autism-associated Shank3 geneleads to deficits in synaptic function, social interaction, and socialcommunication. Molecular autism 1, 15.

Chen, Y., Yu, J., Niu, Y., Qin, D., Liu, H., Li,G., Hu, Y., Wang, J., Lu, Y., Kang, Y., et al. (2017). Modeling Rett syndromeusing TALEN-Edited MECP2 mutant cynomolgus monkeys. Cell. 169, 945-955.

Dhar, S.U., del Gaudio, D., German, J.R., Peters,S.U., Ou, Z., Bader, P.I., Berg, J.S., Blazo, M., Brown, C.W., Graham, B.H., etal. (2010). 22q13.3 deletion syndrome: clinical and molecular analysis usingarray CGH. Am. J. Med. Genet. A. 152a, 573-581.

Failla, P., Romano, C., Alberti, A., Vasta, A.,Buono, S., Castiglia, L., Luciano, D., Di Benedetto, D., Fichera, M., andGalesi, O. (2007). Schizophrenia in a patient with subtelomeric duplication ofchromosome 22q. Clin. Genet. 71, 599-601.

Feng, C., Wang, X.M., Shi, H., Ya, Q.M., Zheng, M.,Li, J., Zhang, Q.J., Qin, YM., Zhong, Y.G., Mi, J.D., Lai, L.X. (2018)Generation of ApoE deficient dogs via combination embryos injection ofCRISPR/Cas9 with somatic cell nuclear transfer. J. Genetics and Genomics 45,47-50

Hare, B., Brown, M., Williamson, C., and Tomasello,M. (2002). The domestication of social cognition in dogs. Science 298,1634-1636.

Jiang, Y.H., and Ehlers, M.D. (2013). Modelingautism by SHANK gene mutations in mice. Neuron 78, 8-27.

Kaminski, J., Hynds, J., Morris, P., and Waller,B.M. (2017). Human attention affects facial expressions in domestic dogs. Sci.Rep. 7, 12914.

Lee, B.C., Kim M.K., Jang g., Oh H.J., Yuda f., KimH.J., Shamim M.H., Kim J.J., Kang S.K., Schatten G., Hwang W.S., et al. (2005).Dogs cloned from adult somatic cells. Nature 436, 641-642.

Liu, Z., Li, X., Zhang, J.T., Cai, Y.J., Cheng,T.L., Cheng, C., Wang, Y., Zhang, C.C., Nie, Y.H., Chen, Z.F., et al. (2016).Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeysoverexpressing MeCP2. Nature 530, 98-102.

Lord, C., Cook, E.H., Leventhal, B.L., and Amaral,D.G. (2000). Autism spectrum disorders. Neuron 28, 355-363.

MacLean, E.L., and Hare, B. (2015). Dogs hijack thehuman bonding pathway. Science 348, 280-281.

Moessner, R., Marshall, C.R., Sutcliffe, J.S.,Skaug, J., Pinto, D., Vincent, J., Zwaigenbaum, L., Fernandez, B., Roberts, W.,Szatmari, P., et al. (2007). Contribution of SHANK3 mutations to autismspectrum disorder. Am. J. Hum. Genet. 81, 1289-1297.

Peca, J., Feliciano, C., Ting, J.T., Wang, W.,Wells, M.F., Venkatraman, T.N., Lascola, C.D., Fu, Z., and Feng, G. (2011).Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.Nature 472, 437-442.

Topal, J., Miklosi, A., and Csanyi, V. (1997).Dog-human relationship affects problem solving behavior in the dog. Anthrozoos10, 214-224.

Wang, G.D., Zhai, W.W., Yang, H.C., Fan, R.X., Cao,X., Zhong, L., Wang, L., Liu, F., Wu, H., Cheng, L.G., et al. (2013). Thegenomics of selection in dogs and the parallel evolution between dogs andhumans. Nat. Commun. 4, 1860

Wang, G.D., Zhai, W.W., Yang, H.C., Wang, L.,Zhong, L., Liu, Y.H., Fan, R.X., Yin, T.T., Zhu, C.L., Poyarkov, A.D., et al.(2016). Out of southern East Asia: the natural history of domestic dogs acrossthe world. Cell Res. 26, 21-33.

Wang, X., McCoy, P.A., Rodriguiz, R.M., Pan, Y.,Je, H.S., Roberts, A.C., Kim, C.J., Berrios, J., Colvin, J.S., Bousquet-Moore,D., et al. (2011). Synaptic dysfunction and abnormal behaviors in mice lackingmajor isoforms of Shank3. Hum. Mol. Genet. 20, 3093-3108.

Wang, X., Xu, Q., Bey, A.L., Lee, Y., and Jiang,Y.H. (2014). Transcriptional and functional complexity of Shank3 provides amolecular framework to understand the phenotypic heterogeneity of SHANK3causing autism and Shank3 mutant mice. Mol. Autism 5, 30.

Wilson, H.L., Wong, A.C., Shaw, S.R., Tse, W.Y.,Stapleton, G.A., Phelan, M.C., Hu, S., Marshall, J., and McDermid, H.E. (2003).Molecular characterisation of the 22q13 deletion syndrome supports the role ofhaploinsufficiency of SHANK3/PROSAP2 in the major neurological symptoms. J.Med. Genet. 40, 575-584.

Zhao, H., Tu, Z., Xu, H., Yan, S., Yan, H., Zheng,Y., Yang, W., Zheng, J., Li, Z., Tian, R., et al. (2017). Altered neurogenesisand disrupted expression of synaptic proteins in prefrontal cortex ofSHANK3-deficient non-human primate. Cell Res. 27, 1293-1297.

Zhao, H., Jiang, Y-H, and Zhang, Y.Q. (2018). Modelingautism in non-human primates: opportunities and challenges. Autism Research, inpress.

Zou, Q., Wang, X., Liu, Y., Ouyang, Z., Long, H.,Wei, S., Xin, J., Zhao, B., Lai, S., Shen, J., et al. (2015).Generation ofgene-target dogs using CRISPR/Cas9 system. J. Mol. Cell. Biol. 7, 580-583.