睡眠干擾所致大鼠學習記憶障礙模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預測，可誘導性是模型制造成功的關鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經生物學機制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發的焦慮、學習記憶障礙及防護藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學結果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機制進行了基礎研究，認為CUMS模型會導致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認為采用慢性不可預測應激，35天可以造成大鼠和小鼠學習記憶障礙。

模型技術難點在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗模型的成功與否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應激程序符合不可預測的特點，以避免動物產生適應性。相同的刺激因子應該隔3-7日再進行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預測應激模型，通過水迷宮、避暗等經典行為學指標，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經遞質基礎機制指標，表明了慢性不可預測應激誘導老鼠學習記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進一步的改善學習記憶藥物的藥效學評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

1. 睡眠干擾對動物體重及自主活動的影響

通過對同一批動物慢性睡眠干抗不同時間體重的檢測結果表明，慢性睡眠干擾７天時，模型組動物體重明顯減輕，到慢性睡眠干擾14天，模型組動物體重有恢復趨勢，說明模型組動物的狀態從不適應造模到適應再到不適應的過程。自主活動實驗結果也表明，慢性睡眠干擾14天對小鼠的總路程、運動時間和靜止時間等指標均無顯著性影響。

表1 不同強度睡眠干擾對小鼠自主活動的影響

2. 新物體識別實驗結果

對照組相對辨別指數顯著大于０，說明對照組動物對熟悉物體有記憶，能夠辨別出熟悉物體和新物體；模型組１（滾筒旋轉方向：固定）和模型組２（滾筒旋轉方向：隨機）相對辨別指數與０比較均無顯著性差異，說明模型組動物不能辨別記憶熟悉物體和新物體。

圖2 不同強度的睡眠干擾對小鼠新物體識別相對辨別指數的影響（模型組1：滾筒方向固定；模型組2：滾筒方向隨機）

3. 水迷宮實驗結果

模型組１（滾筒旋轉方向：固定）定位航行潛伏期在Ｄ１和Ｄ４天顯著増加；模型組２（滾筒旋轉方向：隨機）定位航行潛伏期在Ｄ１、Ｄ４和Ｄ５天均顯著増加。

模型組１（滾筒旋轉方向：固定）目標象限穿臺次數有降低趨勢，但無顯著性差異，目標象限游程比率和目標象限時間比率均無明顯變化；模型組２（滾筒旋轉方向：隨機）目標象限穿臺次數有降低趨勢，但無顯著性差異，目標象限游程比率和目標象限時間比率均顯著降低。表明長期的慢性睡眠干擾使動物的空間學習記憶能力下降。

圖3 不同強度的睡眠干擾對小鼠水迷宮定位航行潛伏期的影響（模型組1：滾筒方向固定；模型組2：滾筒方向隨機）

一般選用SPF級Wistar大鼠（8-10周齡）和ICR小鼠（（4-6周齡）。雄性多見。常規飼養。

1. 模型制作技術規程

使用大、小鼠睡眠干擾儀進行建模，自行設定控制參數，儀器運轉，對睡眠干擾儀內飼養動物進行睡眠干擾。實驗分為兩個階段：

1.1滾筒適應期

在睡眠干擾儀內水瓶裝滿動物飲用水、食物后，將除去空白對照組之外的動物放入睡眠干擾儀中，設置干擾參數如：轉速（1r/min），轉圈1圈，休息時間（2min），隨機轉動。設置完成后，選擇“開始”，實驗開始，儀器開始運轉。每天3小時（每天固定相同時間段），連續滾筒適應3天。實驗結束后打開滾筒壁取出動物，放回動物房。

圖1 睡眠干擾儀裝置圖

1.2 造模期

滾筒適應結束后開始正式造摸，將除去空白對照組之外的小鼠按上述步驟放入睡眠干擾儀，按適應期設定的參數，進行連續睡眠干擾至少14天。空白對照組飼養于動物房內。

2. 模型分析指標

（1）空場實驗 于檢測當天將睡眠干擾儀內的動物取出提前放于檢測房間進行適應，腹腔注射給藥30 min后，將小鼠放入自主活動測試箱內。待小鼠適應測試箱環境3 min后開始檢測，檢測時間為10 min。計算機對攝像頭實時監控到的小鼠視頻圖像進行分析處理后，得到小鼠的總路程、運動時間、靜止時間等一系列指標，以此來分析小鼠的自主活動情況。

（2）新物體識別實驗 實驗過程分為 3 個階段: 適應期、熟悉期、測試期。適應期為 3d， 每天將動物依次放入實驗箱內，熟悉環境 10 min。適應期結束后，次日進行熟悉和測試。熟悉期時，將兩個完全相同的物體放入實驗箱內對稱的位置處，此兩物體距離側箱壁、箱后壁的距離均為 10 cm。記錄小鼠鼠 5 min 內對兩物體的探索總時間。間隔 30 min 后，進入測試期。測試期內，將其中一個熟悉物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體，記錄小鼠對新穎物體和熟悉物體的探索時間，用辨別指數 ( discrimination index，DI) 來評價動物的學習記憶能力。辨別指數計算公式為 DI = ( N-F) /( N + F) ×100% ， 其中N( new) 為新穎物體探索時間，F( familiar) 為熟悉物體探索時間。

在實驗過程中，為避免動物對某一位置產生偏愛，物體的位置要相互平衡，以便減少實驗誤差。新物體識別實驗反映的是動物對物體辨別的短時、非空間記憶能力。

（3）水迷宮實驗

3.1 水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實驗中動物逃離水環境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余 3 個象限作為動物的入水點將動物面向池壁放入水中，每天訓練 3 次，每次變換入水點位置( 使動物可分別從 3 個象限入水)，且每天所有動物入水點的順序保持一致。每次訓練前適應 10 s，使動物獲取并學習空間環境信息。設置檢測時間為 60s 后，將動物放入水中，若動物在 60 s 內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息 10 s。若動物在 60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為 60 s，并引導動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓練的時間間隔為 40 min。每天每只動物 3 次訓練學習的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學習能力的指標。經過 5d 的訓練學習后，第 6 天撤去平臺， 進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在 60s 內在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數，作為評價空間記憶能力的指標。

睡眠干擾(Sleep Interruption，SI)是指由于環境或自身原因無法滿足正常睡眠的情況，一般指在24小時中的睡眠小于4小時。睡眠干擾可以分為部分睡眠干擾（partial sleepinterruption, PSI）和完全睡眠干擾（total sleep interruption, TSI）。TSI指24h之內完全無睡眠；PSI一般指24h之內睡眠量通常達不到4h。從1896年Patrick等首次研究睡眠干擾對人體的影響以來，睡眠的重要性受到了科學界的廣泛關注。包括航空航天航海等軍事特因環境下，由于晝夜生物節律顛倒，睡眠周期紊亂，睡眠不足或睡眠障礙，造成作業人員機體免疫力、作業能力、警覺性和判斷力降低，影響作業任務的完成，嚴重者危及生命。

睡眠干擾包括物理和化學兩種因素誘導的睡眠干擾。化學藥物(多為一些中樞興奮藥)注射可剝奪部分或全部睡眠，如咖啡因、去氧麻黃堿、神經毒素(DSP-4)、可樂定等，但由于睡眠干擾效果不佳，動物個體差異等不易掌握而應用較少。物理睡眠干擾方法包括小平臺水環境、滾筒、水平轉盤、跑臺、人工輕觸刺激等方法。由于小平臺水環境法因頻繁落水造成物溺水死亡率高、人工輕觸刺激需要消耗實驗人員的體力而較少應用。目前應用較多的滾筒、水平轉盤和跑臺等。本文以滾筒法進行介紹。