東莨菪堿誘導(dǎo)老年癡呆癥小鼠模型

給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 不同劑量SCOP對小鼠自主活動的影響

結(jié)果如圖1所示，腹腔注射系列濃度SCOP后，SCOP各劑量組總路程均較正常組明顯升高，呈劑量依賴關(guān)系，隨著檢測時間延長，總路程逐漸減少。各組在腹腔注射SCOP 35min后自主活動度基本趨于穩(wěn)定。

圖 1 東莨菪堿對C57BL/6J 小鼠自主活動的影響

(n=8，means ± SEM). * P<0.05, ** P<0.01 和對照組相比

2. 不同劑量SCOP對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

如圖2所示，各劑量SCOP均能明顯損害小鼠空間參考記憶能力，呈劑量依賴性，表現(xiàn)為定航實(shí)驗(yàn)中，潛伏期和總游程顯著延長、游出率明顯減少，小鼠游泳的平均速度也受到明顯影響。其中SCOP 1 和2 mg/kg對空間記憶能力損害最為明顯，SCOP模型小鼠的搜索策略為典型的邊緣型搜索，訓(xùn)練4天時間幾乎沒有小鼠尋找到平臺。

而由于水迷宮直徑為130cm，對于小鼠來說，難度太大，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，正常組小鼠成績并不理想，SCOP模型組與正常組比較，穿臺次數(shù)、原實(shí)臺象限游程比和時間比均無顯著性差異（圖3）。

圖2 東莨菪堿在水迷宮實(shí)驗(yàn)中對空間參考記憶的獲得的影響

(A)逃避率 (%). (B) 總路程(cm). (C) 逃避潛伏期 (sec). (D) 平均速度(cm/s). * P<0.05, **P<0.01 和對照組相比.

圖3 東莨菪堿在水迷宮實(shí)驗(yàn)中對記憶保留的影響

（n=8，mean±S.E.M）(A) 穿臺次數(shù) (B) 目標(biāo)象限停留時間 (%)

健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，8周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。常規(guī)飼養(yǎng)。

1.藥品的制備

實(shí)驗(yàn)前，以0.9%的生理鹽水溶解東莨菪堿，配制0.1mg/mL（或其他所需濃度）的溶液。溶液配制需在避光條件下完成，且溶液需置于棕色瓶中暫時儲存。

2.造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，根據(jù)隨機(jī)表將小鼠隨機(jī)分為5個組：正常組、SCOP各劑量組（0.25、0.5、1、2 mg/kg/d），于每次行為學(xué)檢測前半小時腹腔注射不同劑量SCOP進(jìn)行造模，給藥體積為0.2ml/10g。

3. 模型分析指標(biāo)

（1）自主活動測試 小鼠自主活動實(shí)時檢測分析處理系統(tǒng)進(jìn)行自主活動實(shí)驗(yàn)，檢測時，將小鼠沿壁放入將小鼠置于測試箱適應(yīng)2~ 3min后，設(shè)定參數(shù)后開始實(shí)驗(yàn)。軟件自動采集分析動物10 min內(nèi)運(yùn)動軌跡，通過總路程、平均速度、運(yùn)動總時間、靜息總時間反映動物自主活動情況。

（2）水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris water maze）

水迷宮空間記憶

迷宮分為 4 個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動物逃離水環(huán)境的唯一途徑， 空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余 3 個象限作為動物的入水點(diǎn)將動物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練 3 次，每次變換入水點(diǎn)位置( 使動物可分別從 3 個象限入水)，且每天所有動物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng) 10 s，使動物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測時間為 60s 后，將動物放入水中，若動物在 60 s 內(nèi)找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息 10 s。若動物在 60 s內(nèi)未找到平臺，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為 60 s，并引導(dǎo)動物靠近平臺使其在平臺上停留 10 s。每只動物訓(xùn)練的時間間隔為 40 min。每天每只動物 3 次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。經(jīng)過 5d 的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第 6 天撤去平臺， 進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在 60s 內(nèi)在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數(shù)，作為評價空間記憶能力的指標(biāo)。

癡呆為一種后天獲得性智能障礙綜合癥，是指意識清晰的病人，由于大腦器質(zhì)性或代謝性病變造成的持續(xù)性、進(jìn)行性智能衰退。老年性癡呆系指65歲以上老年人患有的癡呆。主要有阿爾茨海默癡呆（AD）和血管性癡呆（VD）。阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。由德國神經(jīng)病理學(xué)家Alois?Alzheimer于1906年最先描述。

臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，通常表現(xiàn)為一組癥候群，一般具有慢性或進(jìn)行性的特點(diǎn)，出現(xiàn)多種腦高級皮質(zhì)功能的紊亂，其中包括：記憶、思維、定向、理解、計(jì)算、學(xué)習(xí)能力、語言和判斷功能等，偶爾以情緒控制失常和社會行為異常為前驅(qū)癥狀，其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白 (β-amyloid，β-AP)沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié) (neurofibrillary tangles，NFT)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑(senileplaque，SP) 的形成。傳統(tǒng)上認(rèn)為膽堿能遞質(zhì)缺乏是老年性癡呆的主要原因。老年性癡呆患者認(rèn)知功能損傷與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（Acetylcholine, Ach）水平下降密切相關(guān)。采用M膽堿受體阻斷劑東莨菪堿（scopolamine, SCOP），使腦內(nèi)Ach水平顯著下降，可穩(wěn)定誘導(dǎo)學(xué)習(xí)獲得障礙，其操作簡便，被廣泛應(yīng)用于防治老年性癡呆藥物篩選及評價。

早期癥狀包括：（1）記憶：記憶力減退；時間和定向力減退；思維和判斷力減退。（2）行為：喪失主動性，缺乏生活和工作熱情；情緒淡漠或變得易于緊張和激動。（3）日常生活能力：需要更長的時間完成以前能勝任的工作和家務(wù)。晚期表現(xiàn)：（1）記憶：記不清家人和鏡子中的自己；不能寫出自己的名字，不會簡單的加減法；不能用語言進(jìn)行溝通；（2）行為：身體出現(xiàn)抽搐，伴有吞咽困難及肢體僵硬，最后將臥床不起；穿衣吃飯等行為十分異常；（3）日常生活能力：幾乎完全喪失生活自理能力：自己不能控制大小便。伴隨癥狀-精神及行為異常：幻覺、妄想、抑郁、躁狂、焦慮、睡眠。