微生物檢測指標 微生物檢測包括哪些方面 ?（一）概述：NGS測序在病原微生物檢測中的應用?健明迪

一、無菌操作要求

1. 接種細菌時必需穿任務服、戴任務帽。

2. 停止接種食品樣品時，必需穿公用的任務服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間，任務前經紫外線消毒后運用。

3. 接種食品樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球將手擦潔凈。

4. 停止接種所用的吸管，平皿及培育基等必需經消毒滅菌，翻開包裝未運用完的器皿，不能放置后再運用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精撲滅炙烤三次后運用。

5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，運用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。

6. 接種樣品、轉種細菌必需在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及翻開試管塞都要經過火焰消毒。

7. 接種環和針在接種細菌前應經火焰炙烤全部金屬絲，必要時還要燒到環和針與桿的銜接處，接種結核菌和烈性菌的接種環應在沸水中煮沸5min，再經火焰炙烤。

8. 吸管吸取菌液或樣品時，運用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

二、無菌間運用要求

1. 無菌間通向外面的窗戶應為雙層玻璃，并要密封，不得隨意翻開并設有與無菌間大小相應的緩沖間及推拉門，另設有0.5~0.7m2的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。

2. 無菌間內應堅持清潔，任務后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭任務臺面，不得寄存與實驗有關的物品。

3. 無菌間運用前后應將門關緊，翻開紫外燈，如采用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，運用紫外燈，應留意不得直接在紫外線下操作，以免惹起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球悄然擦拭，除去下面灰塵和油垢，以增加紫外線穿透的影響。

4. 處置和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需求傳遞物品，可經過小窗傳遞。

5. 在無菌間內如需求裝置空調時，則應有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培育基、被污染和接種的培育物等，必需經滅菌前方能運用。干熱和干冷高壓蒸氣鍋滅菌方法。

1.滅菌前預備 （1）一切需求滅菌的物品首先應清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應將下面通氣孔翻開。 （2）裝培育基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。

2.裝放 （1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠且不能接觸箱的四壁。 （2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品區分包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。

3.設備反省 （1）反省門的開關能否靈敏，橡皮圈有無損壞，能否平整。 （2）反省壓力表蒸氣排盡時能否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察能否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況能否吻合，管道有無梗塞。 （3）對有自動電子順序控制裝置的滅菌器，運用前應反省規則的順序，能否契合于停止滅菌處置的要求。

4.滅菌處置

(1)干熱滅菌法： 此法順應于在干熱狀況下，不損壞、不蛻變、不蒸發的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。 ① 器械器皿應清洗后再干烤，以防附著在外表的污物炭化。 ② 滅菌時安放物品不能過擠，不要直接接觸底和箱壁，物品之間留有空隙。 ③ 滅菌時將箱門關緊，接上電源，先將排氣孔翻開約30min，掃除滅菌器中的冷空氣，溫度升至160℃調理指示燈，維持1.5~2h。 ④ 滅菌終了后或溫度升溫進程中，須在60℃以下才干翻開箱門。

(2)手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的運用應按下列步驟停止： ① 手提式高壓鍋在主體內參與3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復運用時應將水量補足，水變混濁需改換）； ② 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管拔出消毒桶內壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕分裂的滅菌器不得運用）； ③ 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并翻開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10~15min）； ④ 封鎖排氣閥，使蒸氣壓上升到規則要求，并維持規則時間（按滅菌物品性質與有關狀況而定）； ⑤ 到達規則時間后，對需枯燥的物品，立刻翻開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復到零時，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要翻開排氣閥，而應立刻將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，溫度降到60℃以下，再開蓋取物，以防突然減壓液體猛烈沸騰或容器爆破。

(3)臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的運用按下列步驟停止： ① 關緊鍋門，翻開進氣閥，將蒸氣引入夾層停止預熱，夾層內冷空氣經阻氣器自動排出； ② 夾層到達預定溫度后，翻開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內冷空氣經鍋室阻氣器自動排出； ③ 待鍋室到達規則的壓力與溫度時，調理進氣閥，使堅持恒定； ④ 自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得運用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體猛烈沸騰或容器爆破； ⑤ 運用自動順序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關緊門后，應依據物品類別按動相應開關，以便按要求順序自動停止滅菌，滅菌時必需應用附設儀表記載溫度與時間以備查，操作要求應嚴厲依照廠家說明書停止；

5.滅菌溫度與時間 (1) 干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5~2h。 (2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間

四、間歇滅菌方法

1.滅菌方法： 應用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。 （1）將欲滅菌物品置于鍋內，蓋上頂蓋，翻開排水口，使器內余水排盡。 （2）封鎖排水口，翻開進氣門，依據需求消毒10~20min。 （3）滅菌終了封鎖進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可到達滅菌目的。

2.血清凝結器運用方法: 培育基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養成份，故用高溫，可使血清凝結，又可到達滅菌目的： （1）在運用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴厲遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌后運用； （2）將培育基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75~90℃一小時后滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3.煮沸消毒： 可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5~15 min，也可在水中參與2%石炭酸煮沸5min，參與0.02%甲醛，80℃煮60min均可到達滅菌目的，但選用煮沸消毒的增消劑時，應留意對物品的腐蝕性。

4.滅菌處置: 滅菌后物品，按正常狀況已屬無菌，從滅菌器中取出應細心反省放置，以免再度污染； （1）物品取出，隨即反省包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品運用； （2）取出的物品，如為包裝有清楚的水浸者，不可作為無菌物品運用； （3）培育基或試劑等，應反省能否契合到達滅菌后的色澤或形狀，未到達者應廢棄； （4）啟閉式容器，在取出時應將篩孔封鎖； （5）取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為遭到污染,不可作為無菌物品運用； （6）取出的合格滅菌物品，應寄存于貯藏室或防塵柜內，嚴禁與未滅菌物品混放； （7）凡屬合格物品，應標有滅菌日期及有效期限； （8）每批滅菌處置完成后，記載滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。

五、有毒有菌污物處置要求

微生物實驗所用實驗器材、培育物等未經消毒處置，一概不得帶出實驗室。

1. 經培育的污染資料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中寄存在指定地點，待一致停止高壓滅菌。

2. 經微生物污染的培育物，必需經121℃，30min高壓滅菌。

3. 染菌后的吸管，運用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，*少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經121℃，30min高壓滅菌。

4. 涂片染色沖洗片的液體，普通可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必需沖在燒杯中，經高壓滅菌前方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗濯。做凝集實驗用的玻片或平皿，必需高壓滅菌后洗濯。

5. 打碎的培育物，立刻用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭潔凈。

污染的任務服或停止烈性實驗所穿的任務服、帽、口罩等，應放入公用消毒袋內，經高壓滅菌前方能洗濯。

六、培育基制備要求

培育基制備的質量將直接影響微生物生長，由于，各種微生物對其營養要求不完全相反，培育目的的不同，各種培育基制備要求如下：

1. 依據培育基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在運用前對運用的試劑藥品應停止質量檢驗。

2. pH測定及調理：pH測定要在培育基冷至室溫時停止，因在熱或冷的狀況下，其pH有一定差異，當測定好時，按計算量參與堿或酸混勻后，應再測試一次。培育基pH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需留意因高壓滅菌可影響一些培育基的pH降低或降低，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培育基的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等普通在調完pH后再參與。

3. 培育基需堅持廓清，便于觀察細菌的生長狀況，培育基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白廓清處置，所用瓊脂條要預先洗凈晾干后運用，防止因瓊脂含雜質而影響透明度。

4. 盛裝培育基不宜用鐵、銅等容器，運用洗凈的中性硬質玻璃容器為好。

5. 培育基的滅菌既要到達完全滅菌目的，又要留意不因加熱而降低其營養價值，普通121℃，15min即可，如為含有不耐高熱物質的培育基如糖類、血清、明膠等，則應采用高溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再參與；

6. 每批培育基制備好后，應做無菌生長實驗及所檢菌株生長實驗。假設是生化培育基，運用規范菌株接種培育，觀察生化反響結果，應呈正常反響，培育基不應貯存過久，必要時可置4℃冰箱寄存。

7. 目前，各種枯燥培育基較多，每批需用規范菌株停止生長實驗或生化反響觀察，各種培育基用相應菌株生長實驗良好前方可運用，新購進的或寄存過久的枯燥培育基，在配制時也應測pH，運用時需依據產品說明書用量和方法停止。

8. 每批制備的培育基所用化學試劑、滅菌狀況及菌株生長實驗結果、制造人員等應做好記載，以備查詢。

七、樣品采集及處置要求

1.所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環境衛生狀況等停止詳細調查，反省能否有污染源存在。

2.依據食品的種類及數量，采樣數量及方法應按規范檢驗方法的要求停止。

3.采樣應留意無菌操作，容器必需滅菌，防止環境中微生物污染，容器不得運用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以防止殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可運用。

4.樣品采集后應立刻送往檢驗室停止檢驗，送檢進程中普通不超越3h，如，路程較遠，可保管在1~5℃環境中，如需冷凍者，則在凍存形狀下送檢。

5.檢驗室收到樣品后，停止注銷（樣品稱號、送檢單位、數量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，假設發現有下列狀況之一者，可拒絕檢驗： (1)樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失掉代表原食品檢驗意義者； (2)瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失掉原食品外形者（食物中毒樣品除外）； (3)按規則采樣數量缺乏者； 對送檢契合要求的樣品，檢驗室收到后，應立刻停止檢驗，假設條件不具有，應置4℃冰箱寄存，及時預備發明條件，然后停止檢驗。

6.樣品檢驗時，依據其不異性狀，停止適當處置。 (1)液體樣品接種時，應充沛混合平均，按量吸取停止接種。 (2)固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225mL滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質器攪碎混勻后，按量吸取接種。 (3)瓶、袋裝食品運用滅菌操作啟開，依據性狀選擇上述方法處置后接種。

八、 樣品檢驗、記載和報告的要求

1. 檢驗室收到樣品后，首先停止外觀檢驗，及時依照國度規范檢驗方法停止檢驗，檢驗進程中要仔細、擔任、嚴厲停止無菌操作，防止環境中微生物污染。

2. 樣品檢驗進程中所用方法、出現的現象和結果等均要用文字寫出實驗記載，以作為對結果剖析、判定的依據，記載要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。

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? NGS技術在臨床上的運用逐漸趨于成熟，從早期的腫瘤基因檢測，到如今大熱的微生物病原核酸檢測，NGS技術以其快速、準確和高分辨率的特點，發揚著無可替代的作用。 ?

微生物在地球上無處不在，從陸地到陸地，從衣物到皮膚，甚至我們的身體外部。

繁衍、變異、自然選擇和生活妥協，是一切生物必需閱歷的。

由于生命的*要義，是生活。

為了生活，必需妥協，生物之間為了爭奪資源，以及生物與自然環境之間，都存在著妥協 ，在這個進程中，有些微生物可以與人類戰爭共處，甚至互利共生，而有的微生物則會使人患病，通常有細菌、真菌、病毒、支原體，以及衣原體，這些就是臨床上的病原微生物。

自然選擇需求閱歷漫長的進程，但是近年來環境污染，藥物濫用，加快了病原微生物的退化速度，耐藥菌，超級菌的出現，嚴重要挾著人類安康。

還有一些微生物，原本與人類沒有交集，原先只存在于自然界，而有人為了獵奇，食用野生植物，從而把這些植物身上攜帶的病毒帶到了人類社會，如本世紀初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，這類新型病毒對公共衛生安康構成了龐大的應戰，一般人的貪心，給全世界的人們帶來了龐大的災難。

當安康遭到了要挾，對付細菌，人類發明了抗生素， 對付病毒，發明了抗病毒藥物，但要如何治療，*步是找出元兇，而這在臨床上往往存在困難。

傳統的血慣例，或許器官和組織的影像學目的可以判別感染的能夠性，但并不能作為確診的依據，比如血慣例只能通知你能否有細菌或病毒感染，但不能通知你是什么細菌或病毒，還需求進一步反省才干確診，以便有的放矢。

實驗室反省，如抗原檢測、核酸檢測、代謝產物檢測以及毒素檢測才是明白感染、指點治療和判別預后的重要手腕。

• 細菌和真菌檢測。通常需求先停止分別培育，再結合生化反響停止鑒定，并進一步停止藥物敏理性實驗，這種形式是臨床微生物實驗室習用的經典形式，為臨床處置了很多關鍵效果，但是其周期長、陽性率低、通量高等弊端往往難以滿足臨床日益增長的需求。
• 病毒、支原體、衣原體檢測。難以像細菌一樣停止分別培育，通常采用分子生物學方法如聚合酶鏈式反響（Polymerase Chain Reaction, PCR）測定核酸，靈敏快速，但只限于已知病原體的檢測，且檢測結果提供的信息相對有限，難以處置由變異帶來的醫學效果。

為了克制傳統方法的缺乏，下一代測序技術（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物檢測中的應用具有十分大的優勢，如：

• 通量大，一次可檢測成百上千個物種，特別是未知的病原，測定其核酸序列是必不可少的手腕；
• 直接測定病原微生物的核酸序列，能為臨床提供準確的診斷依據，如物種鑒定、分型以及耐藥突變等；
• 更低的檢測限，即使病原微生物的豐度很低，也可以檢測到。

當然，NGS的缺陷也是有的：

• 相關于PCR，時效性處于優勢；
• 本錢較高，暫時不會完全取代現行的慣例鑒定手腕。

即使有缺乏，但NGS的技術優勢更為清楚，在疑問微生物，以及難以培育甚至無法分別培育的少見菌屬的鑒定，特別是新型病原微生物的爆發盛行監測方面，NGS快速、準確和高分辨率的特點，使其成為病毒鑒定的金規范，在盛行病學分型中發揚著重要作用。

新型冠狀病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正暴虐全球，目前尚無疫苗和*藥，人們除了戴口罩，留意團體衛生以及添加社交距離外別無他法，面對洶涌的疫情，再一次提示人類，要放下自己是萬物之靈的高傲，由于微生物才是當之無愧的地球*，它們在這個星球上生活的歷史比人類更長，種類和數量也比人類要多得多。

我們不能，也不應該試圖消滅一切微生物。我們之間的關系，不只要對立，還有協作，但是當我們的安康遭到要挾時，也要勇于妥協。

物競天擇，適者生活，人類與微生物的協作與妥協，必將永遠停止下去。